研究成年斑马鱼尾柄骨骼肌再生的冷冻损伤模型

摘要

该协议描述了一种冷冻损伤模型，以诱导成年斑马鱼中几个尾部肌层的严重损伤。该方法为研究非哺乳动物脊椎动物严重丧失组织后的骨骼肌再生提供了一种新方法。

摘要

骨骼肌在轻微损伤后通过激活卫星样干细胞进行更新和恢复。肌肉组织的严重损伤通常会导致人类纤维化。与哺乳动物相比，斑马鱼具有更高的先天器官再生能力，为研究器官广泛损伤后的组织修复提供了强大的模型。在这里，描述了一种冷冻损伤模型，以诱导成年斑马鱼尾柄的四个肌层严重损伤。定制的冷冻探头设计用于贴合体型，并可重复地损伤从皮肤到中线的外侧肌肉组织。重要的是，身体完整性保持不变，鱼继续游泳活动。通过组织切片上肉瘤蛋白的组织学染色和荧光染色来评估骨骼肌的变化。这种方法将开辟新的研究途径，旨在了解骨骼肌的退化如何诱导修复反应，从而重新激活成年斑马鱼的肌源程序。

引言

在脊椎动物中，各种组织的受损部分在生命周期中经历稳态更新和恢复。这种更新和恢复能力通常取决于感受态干细胞的存在或成熟细胞的增殖能力^1,2。骨骼肌包括有丝分裂后肌纤维，其与局部干细胞相关，称为卫星细胞3,4,5,6。因此，该组织包含用于有效密封中断连续性区域或修复小伤口的细胞源。然而，哺乳动物骨骼肌中较大的体积损失通常伴随着非再生修复，例如纤维化⁷。动物模型可以为促进广泛受损器官再生的生物学机制提供新的见解。

斑马鱼是一种成熟的模式生物，具有很高的再生能力。成年斑马鱼可以再生其尾鳍的截肢部分或心室的切除顶点8,9,10,11。此外，以前已将冷冻损伤方法应用于研究斑马鱼^的鳍和心脏再生12,13,14,15。在内脏的情况下，冷冻损伤方法具有诱导细胞死亡而不破坏器官完整性的优点，从而模仿生理条件^16,17。组织碎片在伤口愈合过程中通过自然清除分解，然后是修复过程。然而，这种方法是否可以应用于骨骼肌仍有待确定。

在鱼类中，横向肌肉组织使躯干在游泳过程中能够左右弯曲¹⁸.骨骼肌被组织成同色异构体，称为肌粒，它们被结^缔组织隔开^5,19。斑马鱼可以在轻微的组织破坏后再生肌肉，例如由激光消融或刺伤引起的组织破坏20,21,22,23,24^，但整个肌层是否可以在广泛损伤后再生仍然未知。这种知识上的差距可能是由于缺乏合适的伤害模型。该协议建立了一种新的方法来诱导骨骼肌的广泛损伤，跨越多个肌层。所描述的冷冻损伤方法基于用预冷的不锈钢仪器快速冷冻和解冻肌纤维。尽管受到广泛的破坏，但鱼类的健康并没有受到严重损害。整个肌粒可以恢复，因此，这项工作为研究成年斑马鱼肌肉组织再生机制提供了新的模型系统。

研究方案

这项研究是根据所有相关的道德法规进行的。斑马鱼的繁殖、饲养和维护符合欧洲实验动物科学协会联合会 （FELASA） 准则²⁵。动物舍和所有实验程序均由瑞士弗里堡州兽医办公室批准。

1. 设备和设置

1. 安排在可以制造研究仪器的技术车间生产不锈钢冷冻探头。
   注意：提供具有特定尺寸的仪器设计（图 1A）。
2. 为避免在操作过程中处理探头时冻伤，请将手柄插入移液器吸头，并用胶带包裹。
3. 准备一个用于麻醉工作溶液的烧杯，一个用于处理鱼的勺子，一个潮湿的海绵和一个装有系统水的水箱，让鱼在手术后恢复。
4. 在每次实验前新鲜准备工作溶液。要制备工作溶液，请将 4 mL 三卡因储备溶液加入烧杯中的 100 mL 系统水中。
   注意：麻醉储备液由溶解在 980 mL 蒸馏水中的 4 g 三卡因组成。用1M Tris-HCl，pH 9将pH调节至7后，用蒸馏水将溶液填充至1L。储备溶液对光敏感，应储存在4°C的琥珀色瓶中。

2. 肌肉冷冻损伤手术

1. 通过将探针浸入液氮中至少3分钟开始该过程。将海绵在系统水中弄湿，然后将其放在平坦的表面上。
2. 将一条成年斑马鱼转移到三卡因工作溶液中，并在 1 分钟或 2 分钟后用勺子轻轻触摸鱼以确认其无反应。如果鱼仍然有反应，请再等一会儿。
3. 将麻醉过的鱼放在湿海绵上。将尾柄定位在臀鳍后方和尾鳍前方。
4. 从液氮中取出冷冻探针。轻轻摇动探头，确保尖端上没有残留的液氮。
5. 将刮刀的边缘垂直于身体放在尾柄上（图1C）。将探头保持在此位置6秒，不要施加压力（图1D）。
   注意：冷冻探头的重量足以确保仪器与组织之间的接触。
6. 从组织中释放冷冻探针，并将鱼转移到装有系统水的水箱中。
7. 在鱼从麻醉中醒来后恢复呼吸和游泳时监测它。如果30秒后没有发生眼球运动，通过将系统水移入鳃中来刺激鱼，直到动物自行开始呼吸。
   注意：鱼应在几分钟内在回收水箱中恢复游泳。
   注意：在接下来的几天里，可以拍摄鱼以监测它们的游泳活动（视频1 和 视频2）。在视频录制之前，将对照和受伤的鱼转移到半透明的交配缸中，让它们习惯至少 1 分钟。

3.尾柄采集固定

1. 准备 2 mL 4% 福尔马林或其他适合后续测定的固定剂、培养皿、镊子和手术剪刀。
2. 根据地区兽医办公室给予的法律许可，在冷冻损伤后的选定时间点对鱼实施安乐死。
   注意：安乐死是通过过量服用三卡因溶液（300mg / L）约10分钟进行的。鳃运动丧失和尾鳍夹反射证实死亡。安乐死的时间点应根据再生阶段选择：例如，从冷冻损伤后 1 天 （dpci） 到 3 dpci 进行伤口清除;从3 dpci到10 dpci，用于启动肌肉再生;从 10 dpci 到 30 dpci 进行再生;并在30 dpci后完成组织修复。因此，为了评估肌肉退化和再生的不同步骤和生物学过程，需要在冷冻损伤后的不同时间点对鱼群实施安乐死。
3. 将安乐死的鱼放入含有去离子水的培养皿中。使用剪刀在尾柄的前后进行切口（图1E）。让组织在培养皿的去离子水中流血。
4. 收集尾柄，并用镊子将其转移到微量离心管中制备的固定溶液中。
   注意：小心地将试管倒置几次，并在4°C下过夜。

4.安装尾柄

1. 在摇臂上用1x PBS洗涤固定组织10分钟。然后，将其转移到2mL微量离心管中，其中预冷的30%蔗糖在4°C的去离子水中，并轻轻倒置管数次。将微量离心管在4°C直立位置放置至少24小时。
   注意：尾柄将漂浮在蔗糖溶液的顶部，并随着组织脱水而开始下沉。
2. 用 5 mm 的 O.C.T. 封片剂层填充嵌入模具。用镊子调整培养基中的尾柄。将其放在模具底部，并调整其横向或冠状截面的方向（图1F）。
3. 让培养基在一盒干冰中冷冻。一旦组织稳定在所需位置，在 O.C.T. 完全冻结之前填充模具的其余部分。将模具在-80°C下储存至少1小时。
   注意：在这些条件下，组织可以保存数月。

5. 用低温恒温器切割切片

1. 设置切割厚度为 25 μm 的低温恒温器。将腔室温度调节为 −26°C，将试样温度调节至 −24°C，将切割角度调整至 12°。
2. 将冷冻块与标本一起放入低温恒温器中，并固定其方向以平行于块的底部切割。切割直到到达标本，然后修剪块以简化样本收集。
3. 准备六张粘合玻片。用连续的数字标记载玻片，以准备样品的重复。
4. 开始切割，并在标记的粘附载玻片上收集组织切片。根据进一步的实验需求排列幻灯片上的部分。
5. 让载玻片在室温下干燥1小时。将它们储存在-20°C的封闭盒子中。
   注意：载玻片可以在此条件下安全存放长达 1 年。

讨论

斑马鱼提供了一种脊椎动物模式生物来研究肌肉再生的机制。大多数现有的损伤方法，如激光消融或刺伤，导致相对较小的组织破坏20,21,22,23。已对眼外肌进行了大切除^术26。然而，由于切割体壁对健康有害，这种手术方法可能不太适合侧向肌肉组织。为了避免这种侵入性手术，该协议描述了一种较轻的损伤形式，但会对尾柄造成严重损害。这种方法依赖于表面操作，允许非常精确地瞄准身体一侧的几个子宫肌层。冷冻损伤模型的优势在于其可重复性和产生广泛肌肉退化的能力;基于这些优势，该模型为研究身体如何对显着肌肉损失做出反应提供了新的途径。

极端寒冷的应用导致热休克，其破坏受影响肌肉组织中的质膜和细胞器²⁷。结果，受伤的肌纤维经历了“意外”细胞死亡²⁸。因此，受损组织可以通过伤口清除的自然机制被吸收。斑马鱼对冷冻损伤手术的耐受性很好，因为这项研究的存活率接近 100%，因为预冷探针在确切的持续时间内正确定位在身体上。但是，如果伤口太宽（例如，如果施加的压力太大或冷冻损伤的持续时间太长），鱼可能会在手术后不久表现出异常的游泳运动，并且动物应该被安乐死作为人道终点。对于其他鱼类，冷冻探针的暴露时间应根据身体的大小进行调整。

冷冻损伤后，鱼可以恢复游泳活动，没有任何异常运动的症状。然而，冷冻受伤的鱼游泳的动态性不如对照鱼，这表明有一些轻微的损伤。需要进一步量化冷冻损伤后不同时间点的鱼类行为，以确定游泳性能的时间变化。

冷冻损伤方法对尾柄其他非肌肉组织的影响仍有待阐明。显然，最外层的身体层（即皮肤）因手术而受损。在这种情况下，冷冻损伤方法可以为研究伤口愈合、鳞屑再生和色素沉着模式的恢复提供新的策略。此外，子宫肌层的脉管系统和神经支配也可能受到冷冻损伤的影响，这些主题需要进一步研究。

冷冻损伤模型以前已用于研究斑马鱼心脏再生^13,14,15,29。与心室切除方法¹⁰相比，该方法显示出一些优势，因为富含胶原蛋白的疤痕的瞬时沉积，可以更好地模拟人类的梗死愈合反应³⁰。值得注意的是，斑马鱼可以在多次冷冻损伤后再生心脏³¹。有趣的是，冷冻损伤也被应用于斑马鱼鳍，导致组织溶解过程¹²。与经典的鳍截肢相反，剩余的冷冻损伤残肢包含一个扭曲的边缘，其中有死物质和健康细胞的混合物。对斑马鱼器官（心脏和鳍）的研究表明，即使在广泛的组织损伤后，斑马鱼也能恢复其原始功能成分的强大能力。冷冻损伤的骨骼肌是否激活修复和再生过程之间的相互作用值得未来的研究。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Program
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)
Photoshop Version 23.5.3	Adobe
Material/ Equipment
35/10 mm Petri Dish	Greiner Bio-one	Item No.: 627102
Camera	Sony	/	HDR-PJ410
Cryostat	Histcom	HRA C50
Formaldehyde ~36%	Sigma-Aldrich	47630
Macro 50 mm f/2.8 EX DG lens	Sigma	/	Discontinued lense
Peel-A-Way Embedding Truncated Molds T8	Polyscience, Inc.	18985
Slides Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Sponge	any	any	flat sponge, c.a. 7cm x 3 cm x 1 cm
Stainless steel cryoprobe	Custom-made	/	specifics in the article
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100
Surgical scissors	Any	/
TCS SP2	Leica	/	Discontinoued product
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura Finetek	4583
Tricaine (Anestethic)	Sigma	E10521
Dyes and Antibodies
Dapi	Sigma	10236276001	Concentration: 1/2000
Phalloidin-Atto-565 (F-actin)	Sigma	94072	Concentration: 1 / 500
Tropomyosin (TPM1)	DHSB	CH1	Concentration: 1 / 50
Recipies/Solutions
1x PBS	123 mM NaCl	Sigma
	2.7 mM KCl	Sigma
	10 mM Na2HPO4	Sigma
	1.8 mM KH2PO4	Sigma
AFOG solution	3 g Fuchsin	Fisher Scientific
	2 g Orange G	Sigma
	1 g Anilin blue	Fulka AG
	200 ml acifidied distilled H2O (pH 1.1)