基于Au@Carbon点纳米探针的无标记表面增强拉曼散射生物分析

摘要

在这项研究中，我们开发了一种低成本的基于表面增强拉曼散射（SERS）的指纹纳米探针，具有良好的生物相容性，以显示无标记活细胞生物成像并检测两种细菌菌株，详细展示了如何以无损方法获得活细胞的SERS光谱。

摘要

表面增强拉曼散射（SERS）技术因其能够提供生物样品的分子指纹信息，以及在单细胞分析中的潜力，在生物医学领域受到越来越多的关注。这项工作旨在建立一种基于Au@carbon点纳米探针（Au@CDs）的无标记SERS生物分析的简单策略。在这里，多酚衍生的CD被用作还原剂，以快速合成核壳Au@CD纳米结构，由于协同拉曼增强机制，即使亚甲蓝（MB）的浓度低至^10-9 M，也能提供强大的SERS性能。对于生物分析，Au@CDs可以作为独特的SERS纳米传感器来识别生物样品的细胞成分（例如癌细胞和细菌）。结合主成分分析，可以进一步区分不同物种的分子指纹图谱。此外，Au@CDs还可以进行无标记的SERS成像，以分析细胞内组成谱。该策略提供了一种可行的、无标记的SERS生物分析，为纳米诊断开辟了新的前景。

引言

单细胞分析对于揭示细胞异质性和评估细胞的综合状态至关重要。细胞对微环境的即时反应也保证了单细胞分析¹。但是，当前技术存在一些限制。荧光检测可以应用于单细胞分析，但受到灵敏度低的限制。其他挑战来自细胞复杂的荧光背景和^{长期照射下的}荧光光漂白2。表面增强拉曼散射（SERS）由于其优点，在单细胞分析方面可能符合条件，包括（1）反映固有的分子指纹信息和瞬时情况，（2）超高的表面灵敏度，（3）方便的多重检测，（4）高光稳定性，（5）检测可以量化进行比较分析，（6）避免近红外波长激发的细胞自发荧光，（7）可以在细胞水中进行检测环境，以及（8）检测可以指向小区³、^4、5内的特定区域。

有两种广泛认可的机制可以将SERS理解为一种基本现象：电磁增强（EM）作为主要原因和化学增强（CM）。EM是指在给定频率的激发场中，当入射光的频率与金属中振荡的自由电子的频率相匹配时，由电磁波驱动的集体电子的振荡，从而产生表面等离子体共振（SPR）。当局部SPR（LSPR）通过入射激光撞击金属纳米颗粒（NPs）发生时，它会导致入射光的共振吸收或散射。因此，金属NPs的表面电磁场强度可以提高2到5个数量级⁴。然而，SERS大幅增强的关键不是单个金属NP，而是两个NP之间的差距，这会产生热点。CM从两个方面产生，包括（1）目标分子与金属NP之间的相互作用和（2）目标分子能够将电子转移到金属NP^之间/从金属NP转移电子^4,5。更详尽的细节可以在这些评论文章^4,5中找到。以前的文献中已经提出了几种有前途的活细胞中SERS生物传感和成像方法，例如，检测凋亡细胞⁶，细胞器中的蛋白质⁷，细胞内miRNA，细胞内miRNA，细胞脂质膜，⁹细胞因子¹⁰和活细胞中的代谢物^11，以及通过共聚焦^SERS成像2鉴定和监测细胞，^11,12,13.有趣的是，无标记SERS具有SERS的独特优势，可以描述内部分子光谱⁵。

无标记SERS的一个主要问题是合理可靠的底物。典型的SERS基板是贵金属NPs，因为它们具有出色的散射大量光的能力¹⁴。如今，纳米复合材料因其优异的物理化学性能和生物相容性而受到越来越多的关注。更重要的是，纳米复合材料可以表现出更好的SERS活性，因为纳米杂化物上的热点诱导了强烈的EM和来自其他非金属材料的额外化学增强¹⁵。例如，Fei等人使用MoS 2量子点（QD）作为还原剂来合成Au NP@MoS₂QD纳米复合材料，用于小鼠4T1乳腺癌细胞（4T1细胞）的无标记近红外（NIR）SERS成像¹⁶。此外，Li等人制造了由Au NPs和2D二碲化铪纳米片组成的2D SERS底物，用于食源性致病菌的无标记SERS测量¹⁷。最近，良好的电子供体碳点（CDs）被用作还原剂，无需其他还原剂或辐照来合成Au@carbon点纳米探针（Au@CDs）¹⁸，据报道，基于金核和CD壳之间的电荷转移（CT）效应，碳点（CDs）是增强SERS活性的有效材料^19,20。不仅如此，CD被认为是防止金NPs聚集的封端剂和稳定剂²¹。此外，它为与分析物的反应开辟了更多的可能性，因为它可以提供大量的结合和活性位点²⁰。利用上述优势，Jin等人开发了一种快速可控的方法来制备具有独特SERS特性和出色催化活性的Ag@CD NPs，用于实时监测多相催化反应¹⁸。

本文展示了一种简单且低成本的方法来制造核壳Au@CD SERS底物，以鉴定细胞成分和无标记SERS活细胞生物成像，以及检测和区分 大肠杆菌 （大肠杆菌）和 金黄色葡萄球菌 （S. aureus），这有望为疾病的早期诊断和更好地了解细胞过程。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

1. Au@CDs的制造

注： 图 1 显示了Au@CDs的制造过程。

1. 通过典型的水热处理程序18，使用柠檬酸（CA）和没食子酸（GA）制备CD溶液。将 100 μL 3.0 mg ^mL-1 制备的 CD 溶液加入 200 μL 10 mM 氯金酸 （HAuCl₄）（参见材料表）中，在室温下持续 10 秒，直到产生紫色悬浮液。
2. 在室温下以4,000× g 离心紫色悬浮液10分钟，如果难以去除Au@CD胶体，则使用移液管轻轻除去上清液。
3. 用 200 μL 去离子水（电阻率为 18.2 MΩcm）重悬Au@CDs以洗涤多余的 CD。
4. 重复步骤1.2并获得核壳NP，重新分散在100μL去离子水中，并储存在4°C。 NP可以存储1个月。

2. Au@CDs的表征

1. 透射电子显微镜
   1. 将CD和Au@CD样品在-80°C下过夜，从冷冻溶液中冻干，冻干成粉末后粉碎。
   2. 通过超声处理将获得的粉末样品充分分散到去离子水中，以100%功率，5分钟。
   3. 将几滴样品悬浮液滴到覆盖有花边碳膜的铜涂层TEM网格上，并在干燥后使用透射电子显微镜在200 kV加速电压下捕获图像（参见 材料表）。
2. 傅里叶变换红外光谱 （FT-IR）
   1. 重复步骤2.1.1以获得功率样品，将一些预干燥的KBr颗粒在研钵中研磨成粉末，加入少许样品，同时与KBr粉末混合以进行红外表征¹⁶。
3. 紫外-可见-近红外（UV-vis-NIR）吸光光谱
   1. 以适当的浓度制备CD和Au@CDs悬浮液，以确保吸光度小于1，并进行紫外-对-近红外表征¹⁶。
4. 拉曼光谱
   1. 打开 785 nm 半导体激光器，激光功率为 10 mW，反对放大倍率为 20 倍。将曝光持续时间设置为 5 秒，将累积数设置为 3。
   2. 将等体积的制备Au@CDs样品加入 5 μL 亚甲蓝 （MB） 溶液中并充分混合。
   3. 将一滴悬浮液放在黄铜基板上以收集SERS光谱。

3. 细胞培养

1. 在补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养人上皮肺癌细胞（A549细胞，在实验室中传代），并在37°C的加湿培养箱中用5%CO₂孵育。
2. 将细胞接种在96孔板（1×10⁵ 个细胞/孔）中，并用20-100μM范围内不同浓度的Au@CDs处理。 使用CCK-8检测试剂盒测量细胞活力（见 材料表）。每次处理中使用三个独立的重复项。
3. 要执行 SERS 实验，请按照以下步骤操作：
   1. 将无菌蓝宝石芯片（参见 材料表）放入 12 孔板中，然后将细胞接种到装有 1 mL 培养基的单个孔中。将板在37°C的加湿培养箱中用5%CO₂孵育过夜，以达到70%-80%汇合。
   2. 将Au@CDs加入单孔中并孵育4-6小时。
      注意：孵育前，测试底物的稳定性，尤其是溶液相NP。这些材料在储存和使用过程中容易通过溶解、聚集和沉淀过程降解，这可能会减少电磁损失并降低SERS活性。更重要的是，对于细胞摄取，它可能在很大程度上受到NPs²²的大小的影响。
   3. 在孵育过程中，底物将通过内吞摄取进入细胞。孵育后，在光学显微镜下观察细胞，直到细胞内看到一些黑色颗粒。
      注意：如果SERS强度较弱，请尝试提高Au@CD浓度或延长孵育时间。
   4. 取出培养基，用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 轻轻冲洗蓝宝石片，然后将其浸入 PBS 中进行 SERS 检测¹⁶。

4. 细胞SERS实验

1. 打开计算机，打开拉曼光谱仪，启动软件，然后打开785 nm激光器（见 材料表）。
2. 单击 “新建测量 ”并开始新的光谱采集。在样品测量前用硅晶片校准¹⁷。
3. 使用20倍物镜以确保观察到清晰的细胞图像，然后将物镜更换为50倍。设置激光功率从低到高以及适当的曝光时间和累积。
   注意：在SERS测量之前，请检查适当的激光功率以防止不可逆的电池损坏，并确保采集参数一致。SERS强度与激光功率、光斑尺寸、积累和曝光时间有关。
4. 选择要测量的单元格点，然后单击 运行。每个细胞由 20 个点测量，测量 10 个细胞以取平均值。
   注意：细胞内成分很复杂，导致光谱差异很大。因此，在相似的细胞区域获取光谱并获取尽可能多的光谱。
5. 保存光谱。
6. 单击“ 新建简化图像采集”，然后单击 “视频查看”，选择要拍摄的范围，然后单击 “确定”。设置参数：785 nm边缘流线，中心1,200 ^cm-1，曝光持续时间为5秒，累积数为3，激光功率为50%。
7. 单击“ 活体成像的新”，选择 “信号到基线”，设置从第一个限制 625 到第二个限制 1,700 的范围，然后单击 区域设置。然后设置正确的步骤，然后单击“ 应用”和“确定”。最后，单击 “运行 ”开始执行 SERS 映像。

5. 细菌培养和SERS测量

1. 在 5 mL 的新型 Luria-Bertani （LB） 培养基中稀释大 肠杆菌 和 金黄色葡萄球菌 的过夜培养物 （1：100）（参见 材料表）。在37°C下生长至_{A 600} 0.4至0.6后，将培养物以5,000 ×g 离心5分钟以沉淀细胞。
2. 将沉淀重悬于1mL PBS中，然后进行5分钟5,000 × g 离心（室温下）两次。
3. 将细菌培养物与Au@CDs混合，并直接在SERS平台下方观察混合物。

6. 数据分析

1. 平滑光谱并校正基线。
2. 对处理后的数据执行主成分分析（PCA）¹⁶。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

Au@CDs的制造如图1所示。CD由CA和GA通过典型的水热工艺制备¹⁸。Au@CDs是在室温下通过CD在水性介质中还原HAuCl₄来快速合成的。CD和Au@CDs的大小和形态可以通过TEM和高分辨率（HR）TEM²³观察到。制备的CD是单分散的，尺寸接近2-6nm（图2A）。球形金核涂有一层约2.1nm的CD壳（图2B，C

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

综上所述，已经成功制造了具有2.1 nm超薄CD外壳的Au@CDs。纳米复合材料表现出比纯金NPs更高的SERS灵敏度。此外，Au@CDs在重现性和长期稳定性方面具有出色的性能。进一步的研究包括将Au@CDs作为底物，对A549细胞进行SERS成像³¹并检测两种细菌菌株³²。已经证明，Au@CDs可以用作超灵敏的SERS探针，主要基于金NPs和CD之间的化学增强。

在以前的协议?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS buffer (Cell culture)	Langeco Technology	BL316A
6 well cell culture plate	LABSELECT	11110
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	GLPBIO	GK10001
Citric acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	C108869
CO2 incubator	Thermo Fisher Technologies	3111
Constant temperature magnetic agitator	Sartorius Scientific Instruments	SQP
Cryogenic high speed centrifuge	Shanghai Boxun	SW-CJ-2FD
DMEM high glucose cell culture medium	Procell	PM150210
Electronic balance	Sartorius Scientific Instruments	SQP
Enzyme marker	Thermo Fisher Technologies	3111
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biological Technology	11011-8611
Figure 1	Figdraw.
Fourier infrared spectrometer	Thermo, America	Nicolet 380
Freeze dryer	Tecan	Infinite F50
Gallic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	G104228
Handheld Raman spectrometer	OCEANHOOD, Shanghai, China	Uspectral-PLUS
HAuCl4	Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou)
High resolution transmission electron microscope	Thermo Fisher Technologies	FEI Tecnai G2 Spirit T12
High temperature autoclave	Shanghai Boxun	YXQ-LS-50S
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Yongxin Optical	XD-202
LB Broth BR	Huankai picoorganism	028320
Medical ultra-low temperature refrigerator	Thermo Fisher Technologies	ULTS1368
Methylene blue	Sigma-Aldrich
Pancreatin Cell Digestive Solution	beyotime	C0207
Penicillin streptomycin double resistance	Shanghai Boxun	YXQ-LS-50S
Pure water meter	Millipore, USA	Milli-Q System
Raman spectrometer	Renishaw
Sapphire chip	beyotime
Thermostatic water bath	Changzhou Noki
Ultra-clean table	Shanghai Boxun	SW-CJ-2FD
Uv-visible light absorption spectrometer	MADAPA, China	UV-6100S
Wire 3.4	Renishaw