从人多能干细胞生成功能性胰腺胰岛素分泌细胞的优化方案

摘要

本文介绍了一种用于β细胞样细胞定向分化和功能分析的方案。我们描述了在产生产生胰岛素的胰腺细胞之前，人类多能干细胞的最佳培养条件和传代。六阶段分化从明确的内胚层形成发展到功能性β细胞样细胞，响应葡萄糖分泌胰岛素。

摘要

人类多能干细胞（hPSCs）可以分化成任何类型的细胞，使其成为人类胰腺β细胞的极好替代来源。hPSC可以是源自囊胚的胚胎干细胞（hESC），也可以是使用重编程过程直接从体细胞产生的诱导多能细胞（hiPSC）。这里提出了一个基于视频的方案，概述了hPSCs在分化和随后产生胰岛素的胰腺细胞之前的最佳培养和传代条件。该方法遵循β细胞定向分化的六阶段过程，其中 hPSC 分化为确定性内胚层 （DE）、原始肠管、后前肠命运、胰腺祖细胞、胰腺内分泌祖细胞，最终分化为胰腺β细胞。值得注意的是，这种分化方法需要 27 天才能产生人胰腺β细胞。通过两个实验评估胰岛素分泌的潜力，包括免疫染色和葡萄糖刺激的胰岛素分泌。

引言

人多能干细胞 （hPSC） 具有分化成各种细胞类型的独特能力，使其成为人胰腺β细胞的可行替代品¹。这些 hPSC 分为两种类型：源自囊胚² 的胚胎干细胞 （hESC） 和通过直接重编程体细胞产生的诱导多能细胞 （hiPSC^{） 3}。开发将 hPSC 分化为 β 细胞的技术对基础研究和临床实践都具有重要意义 ^1,4。糖尿病是一种慢性疾病，影响全球 >4 亿人，是由于胰腺β细胞功能障碍或丢失导致身体无法调节血糖⁵.用于移植的胰岛细胞的有限可用性阻碍了糖尿病细胞替代疗法的发展 2,4,6,7。使用 hPSC 产生葡萄糖反应性胰岛素分泌细胞的能力可作为研究人类胰岛发育和功能的有用细胞模型。它还可用于在受控环境中测试糖尿病治疗的潜在候选治疗药物。此外，hPSC 有可能产生与患者基因相同的胰岛细胞，从而降低移植后免疫排斥的风险 ^2,4,7。

近年来，hPSC培养和分化方案的改进取得了重大进展，从而提高了产生胰腺β细胞的分化过程的效率和可重复性^8,9。

以下方案概述了胰腺β细胞定向分化的基本阶段。它涉及在不同时间点对特定细胞信号通路的调节。它基于Sui L.等人¹⁰ （2018）开发的用于将hPSC生成到胰腺β细胞中的方案。该方案根据 Sui L. 等人 ¹¹ （2021） 的最新更新进行了调整，因为最新研究强调了使用阿菲二可林 （APH） 治疗增强β细胞分化的重要性。目前的方案包括在工艺的后期阶段将APH添加到培养基中。此外，与初始方案相比，在分化的早期阶段对培养基的组成进行了修改。一个显着的变化是在第 6 天添加了角质形成细胞生长因子 （KGF），并持续到第 8 天。角质形成细胞生长因子 （KGF） 从第 6 天到第 8 天引入，这与初始方案¹⁰ 略有不同，其中 KGF 不包括在第 4 阶段培养基中。

产生β细胞样细胞的第一步也是必不可少的一步是将hPSC定向分化为最终内胚层（DE），这是一种原始的胚层，可产生包括胰腺在内的各种器官的上皮衬里。DE形成后，细胞分化成原始肠管，随后是后前肠命运的规范。然后前肠后发育成胰腺祖细胞，这些祖细胞有可能分化成胰腺的所有细胞类型，包括内分泌细胞和外分泌细胞。该过程的后续阶段涉及胰腺内分泌祖细胞，从而产生在朗格汉斯胰岛中发现的激素分泌细胞。最后，分化过程通过产生功能齐全的胰腺β细胞样细胞达到最后阶段 ^9,10。需要注意的是，该过程很复杂，通常需要优化培养条件，例如特定的生长因子和细胞外基质成分，以提高分化的效率和特异性^9,10。此外，在体外从hPSCs中产生功能性β细胞样细胞仍然是一个主要挑战。正在进行的研究重点是改进分化方案并增强所得β细胞的成熟度和功能⁹.

在该方案中，在hPSC的培养和传代过程中使用温和的细胞解离对于维持细胞活力和多能性至关重要，从而显着提高分化为胰腺β细胞的效率。此外，每种阶段特异性培养基都按照Sui L.等人^{开发的方案进行了精心优化10} ，以促进与人类胰岛非常相似的簇中胰岛素分泌细胞的高产量。

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研究方案

在开始分化之前，建议确定用于实验目的的胰岛样类器官的所需数量。在 6 孔板中，汇合度超过 80% 的单个孔通常由 2-230 万个 hPSC 组成。虽然由于 hPSC 细胞系和分化效率的变化，准确预测具有挑战性，但粗略估计是初始孔数的 1.5 倍。有效的定向分化通常在六孔板中每孔产生 1.6 至 200 万个细胞，包括簇内的所有细胞，而不是仅产生胰岛素的细胞。对于 50 μm 的团簇，它可以近似包含大约 10,000 个细胞。 表1 总结了在干细胞基质和培养基上用于定向分化的每天/阶段的培养基组成，以及葡萄糖刺激的胰岛素分泌缓冲液。

1. 在 6 孔板中分化前传代人多能干细胞

注意：在分化为β细胞样细胞之前，人类干细胞的适当传代是建立实验过程的关键步骤。不正确的传代稀释或附着细胞数量会影响分化效率和保真度。

1. 制备干细胞培养基、包衣和解离溶液（如 表1所示）。
2. 传代前1-2小时，用冷包衣溶液（每孔1mL）涂覆六孔板，并在37°C，5%CO₂孵育。
3. 在室温（15-25°C）下加热等分的干细胞培养基20分钟。
4. 吸出干细胞培养基并加入 1 mL 无钙/无镁 D-PBS。
5. 重复步骤 1.4。两次。
   注意：添加D-PBS以洗涤细胞并除去先前的培养基和化合物。需要注意的是，洗涤步骤不需要特定的时间范围，因为暴露于D-PBS不会损害hPSC，防止渗透引起的细胞破裂或收缩。
6. 吸出D-PBS，为每个孔加入500μL解离溶液，并在室温（15-25°C）下静置2-5分钟。
7. 当细胞解离时，吸出新 6 孔板的包被溶液，并向每个孔中加入 1-2 mL 无钙/无镁 D-PBS。
8. 定期在倒置显微镜下检查解离过程。
9. 当80-90%的细胞已经变圆但仍粘附时，吸出解离溶液。
10. 加入 1 mL 含有 10 μM ROCK 抑制剂的干细胞培养基。
11. 使用 1,000 μL 无菌过滤移液器吸头和 P1000 移液器将解离的细胞收集到 15 mL 锥形管中。
12. 用 1,000 μL 无菌移液管过滤吸头在移液管中缓慢地上下研磨细胞悬浮液以破坏菌落，但不要超过 10 次。
13. 加入 1 mL 含有 ROCK 抑制剂的干细胞培养基，以帮助分离剩余的 hPSC，并将细胞悬液转移到相同的 15 mL 锥形管中 （1.10）。
14. 从新包被的板中吸出D-PBS，并立即从15mL锥形管中加入细胞悬液。为确保最佳细胞生长，当使用 6 孔板时，每孔接种 2 x 10⁵- 1 x 10⁶ 个活细胞（1/10 至 1/50 分裂）。
    注意：对于体积计算，6孔板的每个孔必须含有2mL含有ROCK抑制剂的干细胞培养基。
15. 快速来回移动盘子，左右移动 5 - 10 次。
16. 将板置于37°C，5%CO₂ 培养箱中24小时。
17. 第二天更换不含ROCK抑制剂的新鲜干细胞培养基，然后每2天一次，直到hPSCs的汇合度达到80-95%。

2. 人干细胞来源的β细胞定向分化

注意：当达到80-95%的汇合时，hPSC可用于直接分化为胰腺β细胞的过程。

1. 第 -1 天：细胞传代 分化第 -1 天：
   1. 传代前1-2小时，在37°C，5%CO₂ 培养箱中用冷包衣溶液涂覆6孔板1小时。
   2. 按照步骤 1.1 到 1.10 进行计数，然后继续计算单元格。
   3. 加载 10 μL 细胞混合物，加入等体积的台盼蓝，轻轻混合。
   4. 计算细胞浓度。使用 0.8 × 10⁶ 个细胞/mL - 1.0 x 10⁶ 个细胞/mL 含有 10 μM ROCK 抑制剂的干细胞培养基，每孔铺板 2 mL 培养基。
   5. 快速来回移动盘子，左右移动三次。
   6. 将板置于37°C，5%CO₂ 培养箱中。快速来回移动板，再次左右移动 10 次。然后将板孵育4小时。
      注意：一旦放入培养箱中，通过移动板来确保细胞的最大附着和均匀分布不会干扰细胞。非常小心地打开和关闭培养箱。
   7. 将一瓶基础培养基在4°C下放置第0至4天，使其解冻过夜。
2. 第0天
   注意：hPSCs必须是80-95%的汇合，不要在该汇合下开始分化过程到最终的内胚层。
   1. 在冰上，解冻第 0 至 4 天的基础培养基和补充剂（参见 材料表）。
   2. 在两个锥形管中仅制备第 1 天使用的必要体积（6 孔板每孔 2 mL），并在单独的管中，将第 2.5 至 4 天的体积增加一倍（6 孔板每孔 2 x 2 mL）。将第2.5天至第4天培养基储存在4°C。
   3. 在37°C水浴中加热必要体积的第1天培养基和洗涤培养基1的等分试样5分钟。
   4. 吸出干细胞培养基并加入 2 mL 洗涤培养基 1。
      注意：方案中使用的洗涤培养基由特定于每天/阶段的基础培养基组成，并辅以 1% 抗生素。直接区分方案的洗涤步骤仅涉及按照所述程序2.2.4添加指定的洗涤介质（称为“洗涤介质1或2”， 材料表）和随后的抽吸。值得一提的是，这些洗涤步骤没有具体的时间范围。
   5. 吸出洗涤培养基 1，并立即将 2 mL 第 1 天培养基加入孔侧。
   6. 将细胞在37°C和5%CO₂ 下孵育24小时。
3. 第1天
   1. 在37°C水浴中预热必要体积的2.5至4天培养基的等分试样5分钟。
   2. 吸出第 1 天培养基，并立即将第 2.5 至 4 天培养基的 2 mL 加入到孔的一侧。不要清洗细胞。
   3. 将板放回37°C和5%CO₂ 下36小时。
4. 第 2.5 至 4 天
   1. 在37°C水浴中预热第2.5至4天剩余体积的等分试样5分钟。
   2. 吸出培养基，并立即将 2 mL 新鲜制备的第 2.5 至 4 天培养基加入孔的一侧。
   3. 将板放回37°C和5%CO₂ 下36小时。
5. 第4天
   注意：在这个阶段，明确的内胚层标志物的表达达到最大值，细胞可以启动原始肠管分化。
   1. 准备必要体积的第4天原始肠道阶段培养基（六孔板每孔2mL）的等分试样，并在室温（15°C-25°C）下加热20分钟。
   2. 吸出第 2.5 至 4 天培养基并加入 2 mL 洗涤培养基 1。
   3. 吸入洗涤介质1，并立即将2 mL第4天原始肠道阶段加入到孔的一侧。
   4. 将板放回37°C和5%CO₂ 下48小时。
6. 第 6 至 8 天
   注意：在这个阶段，细胞开始进一步分化到后前肠命运。
   1. 准备必要体积的第6至8天后前肠培养基（6孔板每孔2mL），并在室温（15°C-25°C）下加热培养基20分钟。
   2. 吸出第 4 天培养基，并立即将 2 mL 第 6 至 8 天后前肠培养基添加到孔的一侧。
   3. 将板置于含有5%CO₂ 的37°C培养箱中48小时。
7. 第 8 至 12 天
   注意：细胞已准备好进行胰腺祖细胞的分化。
   1. 准备必要体积的第8至12天胰腺祖细胞阶段培养基（6孔板的每孔2mL），并在室温（15°C-25°C）下加热培养基20分钟。
   2. 吸出第 6 至 8 天培养基，并立即将 2 mL 第 6 至 8 天的后前肠培养基添加到孔的一侧。
   3. 将板置于含有5%CO₂ 的37°C培养箱中48小时。
8. 第 12 天：执行群集步骤
   注意：在这个阶段，细胞形成致密的单层，并将过渡到3D细胞培养以形成簇。这一步骤对于分化至关重要，以增强β样细胞与人类天然胰岛的结构相似性，同时也改善了它们在细胞和簇水平上的功能相似性¹¹（图1）。
   1. 在室温（15°C-25°C）下用2mL抗粘性冲洗溶液处理含有400μm微孔的6孔板（如 材料表：人类干细胞衍生的β细胞定向分化，第12天）。
      注意：微孔可防止细胞附着在孔底，并促进3D簇的机械形成。
   2. 离心板以1,300× g 离心5分钟。
   3. 在倒置显微镜下检查是否存在任何气泡。如果没有观察到气泡，则吸入抗粘连漂洗液并立即加入2 mL洗涤介质2（材料表）。
   4. 重复步骤 1.8.3。两次。
   5. 准备必要体积的团簇培养基，并在室温（15-25°C）下加热20分钟。确保 6 孔板的两个孔进入 400 μm 微孔 6 孔板的一个孔中，其中含有 4 mL 团簇培养基。
   6. 抽吸胰腺祖细胞培养基并加入解离缓冲液（每孔 0.5 mL）。
   7. 在室温（15°C-25°C）下孵育2-5分钟。定期在倒置显微镜下检查解离过程，并在大多数细胞变圆但仍粘附时抽吸解离缓冲液。
   8. 吸出解离缓冲液，并立即向每个孔中加入 1 mL 簇状培养基。
   9. 使用 P1000 移液器和 1,000 μL 滤嘴轻轻上下移液 6 次，解离细胞。
   10. 将细胞和簇培养基混合物转移到 50 mL 锥形管中。
   11. 加入 1 mL 簇培养基以收集所有剩余细胞。
   12. 将簇培养基添加到所需的总体积中，使微孔板的每个孔具有 4 mL 混合物簇培养基/细胞。
   13. 从微孔6孔板中吸出洗涤介质2并转移细胞悬浮液。将板在37°C孵育24小时。
9. 第 13 天：从第 13 天开始处理细胞聚集后并更换其培养基。
   注意：集群高度敏感，需要小心处理，以确保其在接下来的几天内的完整性和活力。因此，在第 12 天之后的聚集后期间密切监测集群至关重要。定期评估和调整对于促进实验过程的成功结果至关重要。
   1. 准备必要体积的第 13 天培养基（6 孔板每孔 2 mL），并在单独的 50 mL 锥形管中用于第 15 至 20 天胰腺内分泌祖细胞培养基。
   2. 使用 p1000 移液器和 1,000 μL 过滤吸头将微孔 6 孔板中的团簇缓慢收集到 50 mL 锥形管中。
   3. 加入 1 mL 第 13 天培养基以收集剩余的簇并将簇转移到试管中。
   4. 让细胞在重力作用下自然凝固至锥形管底部5分钟。
   5. 从试管中吸出尽可能多的上清液，而不会干扰细胞簇。移液器吸头不应接触或吸出簇，而只能吸入上清液。
   6. 根据以下方法加入必要体积的第 13 天培养基：1 孔微孔 6 孔板进入低附着 6 孔板的 3 孔（每孔 2 mL 培养基）。
   7. 轻轻上下移液，避免吸气簇。
   8. 将悬浮液转移到粘附度非常低的 6 孔板上。
   9. 快速来回移动盘子，左右移动六次。
   10. 将板在37°C孵育48小时。
   11. 按照第 2.9 节所述，在所有后续步骤中执行介质更改，直到微分结束。
10. 第 15 至 20 天
    1. 通过将细胞悬液收集到 50 mL 锥形管中并按照第 13 天的步骤 2.9.4 至 2.9.10，每 48 小时更换一次胰腺内分泌祖细胞分期培养基，直到分化第 21 天。
11. 第 21 至 27 天
    注意：在这个阶段，簇分化为胰腺β细胞。
    1. 制备胰腺β细胞阶段培养基。
    2. 如第 15 至 21 天所述，每隔一天更换一次培养基。
       注意：第 25 天后，胰岛样类器官可以进行分析以确认它们功能齐全。

3. 胰腺β细胞簇染色

注意：执行此步骤以研究分化后簇的功能评估

1. 分化结束时，在 1.5 mL 微量离心管中收集 5 至 10 个簇。
2. 在室温下用 200 μL 4% PFA 固定细胞簇 15 分钟。
3. 向簇中加入 1 mL PBS，并用 1,000 μL 移液器吸头取出 PBS，而不会干扰簇。
4. 向簇中加入200μL30%蔗糖，并在4°C下孵育过夜。
5. 将簇转移到冷冻模具中，除去多余的蔗糖，加入一滴 O.C.T. 培养基，并将簇与 O.C.T. 培养基混合。
6. 将冷冻剂冷冻在干冰上并储存在-80°C。
7. 使用切片机/或冷冻恒温器从显微镜载玻片上的冷冻块上切下5μm切片。
8. 将载玻片储存在-80°C冰箱中直至染色。
9. 在染色当天，将载玻片从-80°C冰箱中取出。
10. 小心地清除冷冻模具部分周围的冰。
11. 用疏水笔在载玻片上圈出细胞簇。
12. 在含有PBS的载玻片染色罐中重水化载玻片15分钟。
13. 将冷甲醇加入载玻片染色罐中，并将装有载玻片的罐子置于-20°C10分钟。
14. 将载玻片浸入 PBS 罐中。
15. 重复步骤 3.14 三次。
    注意： 将此方法用于以下所有洗涤步骤。
16. 从载玻片中取出PBS，并立即用100μL含有2-5%BSA的PBS-T封闭溶液覆盖。
17. 向每张载玻片添加封闭溶液并用石蜡膜覆盖。
18. 在室温（15-25°C）下孵育1小时。
19. 使用试剂和溶液部分中提供的比率稀释封闭溶液中的一抗。
20. 从载玻片上取下封闭溶液。
21. 立即加入稀释的抗体并用封口膜覆盖载玻片，以防止载玻片变干。
22. 在4°C孵育过夜。
23. 第二天用PBS-T清洗载玻片3-5次。
24. 制备稀释的二抗和DNA染料。
25. 从载玻片中取出多余的 PBS-T。
26. 加入稀释的二抗和 DNA 染料。在室温（15-25°C）下孵育45分钟。
27. 用 PBS-T 清洗载玻片 3-5 次。
28. 从载玻片中取出任何液体。
29. 在每个切片中加入一滴组织学封固剂。
30. 用玻璃盖盖住载玻片。
31. 使用荧光显微镜拍摄染色载玻片的照片。

4. GSIS（葡萄糖刺激胰岛素分泌测定）

1. 制备三种不同的溶液：低糖KREBS溶液，高糖KREBS溶液和含KCl的低葡萄糖KREBS溶液。
2. 在37°C水浴中加热所有溶液。
3. 使用 1000 μL 移液器吸头仔细选择约 10 - 15 个大小相似的簇，并将它们与少量差异化培养基一起转移到 1.5 mL 试管中，以避免簇变干。
   注意：簇应该是肉眼可见的，但如果没有，将含有分化簇的板放在倒置显微镜下以选择簇并将它们转移到 1.5 mL 管中。
4. 将带有团簇和培养基的管子放在管架上，等待管簇沉到管子的底部。
5. 使用 200 μL 移液管缓慢吸出上清液，并加入 200 μL 低葡萄糖 KREBS 溶液。
6. 将胰岛在低葡萄糖溶液中在37°C孵育1小时。
   注意：为确保准确评估簇数和实验中的一致性，建议在转移过程中检查溶液中是否存在所有簇，因为它们往往会粘附在管上。
7. 从培养箱中取出试管，缓慢吸出 200 μL KREBS 溶液，而不吸出任何团簇。
8. 加入200μL低葡萄糖KREBS溶液，并在37°C孵育30分钟。
9. 将体积为200μL的低葡萄糖KREBS溶液吸入500μL管中，并立即将其储存在-80°C进行胰岛素测量。重复进行单独的治疗。
10. 要洗涤团簇，将 200 μL 不含葡萄糖的 KREBS 溶液加入含有团簇的管中。让团簇沉降到试管底部，并在不干扰团簇的情况下小心地去除上清液。
11. 加入200μL高糖KREBS溶液，并在37°C孵育30分钟。
12. 将200μL高葡萄糖KREBS吸入500μL管中，并立即将其储存在-80°C进行胰岛素测量。重复进行单独的治疗。
13. 要洗涤团簇，将 200 μL 不含葡萄糖的 KREBS 溶液加入含有团簇的管中。让团簇沉降到试管底部，并在不干扰团簇的情况下小心地去除上清液。
14. 加入 200 μL KCl KREBS 溶液并重复进行单独处理。
15. 在37°C孵育30分钟。
16. 将200μLKCl KREBS溶液吸入500μL管中，并立即将其储存在-80°C进行胰岛素测量。重复其他治疗。
17. 加入 50 μL 超纯水，然后继续测量总胰岛素含量。
18. 将 150 μL 酸性乙醇溶液加入装有胰岛和超纯水的试管中。
19. 将样品储存在4°C过夜（12-15小时）。
20. 第二天，涡旋每个样品。
21. 使用设置为 20% 功率的电动超声仪进行超声处理 1 秒，以确保胰岛组织完全裂解。
    注意：重复步骤 4.21，直到没有剩余的集群可见。
22. 将所有样品以10,000× g 离心10分钟，并保持上清液。
23. 使用纳米滴分光光度计测量 DNA 浓度，然后可用于标准化胰岛素测量。

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结果

本文中描述的方案提供了一种从 hPSC 中区分 β样细胞的高效方法¹⁰。该过程利用易于扩展的 2D 培养系统，使其能够在各种实验环境中使用，例如学习分化、小型项目和实验室以及中试测试，以评估 iPSC 细胞系的分化潜力。

表征胰岛中分化β细胞的功能特性对于深入了解葡萄糖稳态至关重要。这通常通过各种实验来实现，例如β细胞标志物和胰岛素表达的免疫?...

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讨论

hPSCs成功分化为胰腺β细胞取决于优化所选hPSCs的常规培养和传代的各个方面。这包括确保细胞系具有正常的核型，对支原体感染呈阴性，并且没有质粒或病毒载体基因组。此外，在使用hiPSCs时，重要的是要避免使用仍在进行重编程的最早传代进行试点实验。这些实验应在小规模上进行，以确定具有最佳分化潜力和最佳传代次数的hPSC系。

其他可能影响分化效率的参数包括所用?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube	Starlabs	S1615-5500
6-well Cell culture plate	ThermoFisher Scientific	165218
AggreWell 400 6-well plate	STEMCELL Technologies	34425
Anti-Glucagon	Sigma-aldrich	G2654-100UL
Anti-Insulin	Dako	A0564
Anti-NKX6.1	Novus Biologicals	NBP1-49672SS
Anti-PDX1	Abcam	ab84987
Aphidicolin	Sigma-Aldrich	A4487
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid free	Sigma-Aldrich	A3803-100G
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Calcium/Magnesium free D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
Cyclopamine-KAAD	Calbiochem	239804
D-(+)-Glucose,BioXtra	Sigma-Aldrich	G7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous	Sigma-Aldrich	94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566016	For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides	Thermo Fisher Scientific	10149870
Ethanol	VWR	20821.33
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XX	Thermo Fisher Scientific	J64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647	Abcam	ab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Thermo Fisher Scientific	A-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11011
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0094
Hydrogen chloride	Sigma-Aldrich	295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Agar Scientific	AGG4582
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272-500G
OCT Compound 118 mL	Agar Scientific	AGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents	Thermo Fisher Scientific	7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)	Thermo Fisher Scientific,	15070-063
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Recombinant Human EGF Protein	R&D Systems	236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mm	VWR	631-0137
RepSox (Hydrochloride)	STEMCELL Technologies	72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870036	For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-500G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	7558-80-7
STEMdiff Endoderm	STEMCELL Technologies	5110
StemFlex Medium	Thermo Fisher Scientific	A3349401	Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid	Reprocell	04-0021
Thyroid Tormone 3 (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
TrypL Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific	12604013
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture	Thermo Fisher Scientific	38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72302
Zinc Sulfate	Sigma-Aldrich	Z4750