外泌体胶原贴片和体外循环冠状动脉旁路移植术治疗慢性心肌缺血的外科猪模型

Summary

本研究提出了进行性冠状动脉狭窄导致的慢性心肌缺血的外科猪模型，导致心脏功能受损而无梗死。缺血后，动物接受非体外循环冠状动脉旁路移植术，心外膜放置干细胞来源的富含外泌体的胶原蛋白贴片。这种辅助治疗可改善心肌功能和恢复。

Abstract

进行性冠状动脉狭窄导致的慢性心肌缺血导致冬眠心肌 （HIB），HIB 定义为通过降低代谢活动来适应氧气供应减少的心肌，从而防止不可逆的心肌细胞损伤和梗死。这与心肌梗死不同，因为 HIB 具有通过血运重建恢复的潜力。患有严重冠状动脉疾病 （CAD） 的患者会出现慢性缺血，这使他们面临心力衰竭和猝死的风险。重度冠状动脉旁路移植手术 （CABG） 是重度冠状动脉旁路移植手术 （CABG），但它已被证明是一种不完美的治疗方法，但尚无辅助疗法来恢复适应慢性缺血的肌细胞。 为了解决这一差距，使用适合 CABG 并模拟临床场景的猪 HIB 手术模型。该模型涉及两次手术。第一次手术涉及在左前降支 （LAD） 上植入 1.5 mm 的刚性收缩器。随着动物的生长，蟒蛇逐渐引起明显的狭窄，导致区域收缩功能下降。一旦狭窄达到 80%，心肌血流和功能就会受损，从而产生 HIB。然后使用左乳内动脉 （LIMA） 进行非体外循环 CABG，以使缺血区域血运重建。动物恢复一个月，以便在牺牲前获得最佳的心肌改善。这允许对不同的治疗组进行生理和组织研究。该动物模型表明，尽管进行了 CABG，但心脏功能仍然受损，这表明需要新的辅助干预。在这项研究中，开发了一种嵌入间充质干细胞 （MSC） 衍生外泌体的胶原贴片，该贴片可以通过手术应用于 LIMA 吻合口远端的心外膜表面。该材料符合心外膜，可吸收，并为信号因子的持续释放提供支架。这种再生疗法可以刺激心肌恢复，而仅对血运重建没有反应。该模型通过提供有关 HIB 恢复的生理和机制探索手段，转化为临床领域。

Introduction

在全球范围内，重症冠状动脉疾病影响超过一亿患者，尽管死亡率有所下降，但它仍然是导致死亡的主要原因之一^1,2。冠状动脉疾病的临床范围很广，从心肌梗死 （MI） 到缺血，但仍能存活。大多数临床前研究都集中在心肌梗死上，其特征是存在梗死组织，因为可以在小型和大型动物模型中进行研究。然而，该模型并不能解决保留活力和适合血运重建的患者。大多数接受 CABG 的患者血液供应减少和功能受限，同时保持收缩储备和活力的可变^{性 3}.如果不进行治疗，这些患者可能会进展为晚期心力衰竭和猝死，尤其是在工作量增加^{的情况下 4}.在这些患者中，冠状动脉旁路移植术 （CABG） 是一种有效的治疗方法，但可能无法完全恢复功能⁵。重要的是，舒张功能障碍是较差临床结果的标志，在血运重建后无法恢复，这表明在 CABG ^6,7 期间需要新的辅助治疗。目前，尚无临床上可用的辅助干预措施与 CABG 一起使用，以将心肌细胞恢复到全部功能能力。这是一个重大的治疗差距，因为尽管进行了适当的血运重建，但许多患者仍会发展为晚期心力衰竭⁸。

Protocol

明尼阿波利斯退伍军人医疗中心和明尼苏达大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）已经批准了所有的动物研究。遵循了美国国立卫生研究院（NIH）关于使用和护理实验动物的现行指南。

1. 间充质干细胞的分离及外泌体的制备和表征

1. 骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离
   1. 从 20 周龄雌性约克郡长白猪的胸骨或胫骨获取 30-50 mL 无菌骨髓。为此，将 25 mm 15G 骨间针插入胸骨或胫骨，并将样本吸入装有 10 mL 肝素的 60 mL 注射器中。
      注意：有关骨髓收集的更多详细信息，请参阅Pittenger等人和Hocum-Stone等人^12,16。
   2. 简而言之，将骨髓标本通过含有肝素的Vacutainer CPT管以1800×g的速度持续30分钟。
   3. 去除含有单核细胞的血沉棕黄层，并用Hank的平衡盐溶液洗涤。通过离心沉淀单核细胞并重悬于生长培养基（10%胎牛血清[FBS]）中。
   4. 将单核细胞转移到细胞培养瓶中进行贴壁生长。通过其贴壁性将MSC从单核部分中分离出来。
   5. 在24小时内洗涤所有非MSC，在组织培养瓶中留下单层MSC。通过流式细胞术确认 MSC 表型，确保 CD45（造血标志物）呈阴....

Discussion

本研究提出了第一个慢性缺血性心肌的猪模型，其中表明，在手术血运重建期间，用 MSC 衍生的外泌体负载胶原蛋白贴片治疗可在正性肌力刺激下恢复舒张和收缩功能，可能通过靶向线粒体恢复。先前，研究表明，在HIB的大型动物模型中，通过心脏MRI测量的舒张和收缩功能仍然受损，并且仅随着血运重建而略有改善，而没有完全恢复^6,19。尽管左心室射?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 Ethibond	Ethicon	MG46G	Suture
# 40 clipper blade	Oster	078919-016-701	Remove hair from surgery sites
0 Vicryl	Ethicon	J208H	Suture
1 mL Syringe	Medtronic/Covidien	1188100777	Administer injectable agents
1" medical tape	Medline	MMM15271Z	Secure wound dressing and IV catheters
1000mL 0.9% Sodium chloride	Baxter	2B1324X	IV replacement fluid
12 mL Syringe	Medtronic/Covidien	8881512878	Administer injectable agents
18 ga needles	BD	305185	Administration of injectable agents
20 ga needles	BD	305175	Administration of injectable agents
20 mL Syringe	Medtronic/Covidien	8881520657	Administer injectable agents
2-0 Vicryl	Ethicon	J317H	Suture
250 mL 0.9% saline	Baxter	UE1322D	Replacement IV Fluid
3 mL Syinge	Medtronic/Covidien	1180300555	Administer injectable agents
3-0 Vicryl	Ethicon	VCP824G	Suture
36” Pressure monitoring tubing	Smith’s Medical	MX563	Connect art. Line  to transducer
4.0 mm ID endotracheal tube	Medline	DYND43040	Establish airway for Hibernation
4-0 Tevdek II Strands	Deknatel	7-922	Suture to secure constrictor around LAD
48” Pressure monitoring tubing	Smith’s Medical	MX564	Connect art. Line  to transducer
500mL 0.9% Sodium chloride	Baxter	2B1323Q	Drug delivery, Provide mist for Blower Mister
6  mL Syringe	Medtronic/Covidien	1180600777	Administer injectable agents
6.0 mm ID endotracheal tube	Mallinckrodt	86049	Establish airway for Revasc,MRI and Termination
6.5 mm ID endotracheal tube	Medline	DYND43065	Establish airway for Revasc,MRI and Termination
6” pressure tubing line	Smith’s Medical	MX560	Collect bone marrow
60 mL Syringe	Medtronic/Covidien	8881560125	Administer injectable agents
7.0 mm ID endotracheal tube	Medline	DYND43070	Establish airway for Revasc,MRI and Termination
7-0 Prolene	Ethicon	M8702	Suture
Advanced DMEM (1X)	ThermoFisher Scientific	12491023
Alcohol Prep pads	MedSource	MS-17402	Skin disinfectant
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC910024
Anesthesia Machine	Drager	Fabious Trio	maintains general anesthesia
Anesthesia Machine + ventilator	DRE Drager- Fabius Tiro	DRE0603FT	Deliver Oxygen and inhalant to patient
Anesthesia Monitor	Phillips  Intellivue	MP70	Multiparameter for patient safety
Arterial Line Kit	Arrow	ASK-04510-HF	Femoral catheter for blood pressure monitoring
Artificial Tears	Rugby	0536-1086-91	Lubricate eyes to prevent corneal drying
Bair Hugger	3M	Model 505	Patient Warming system
Basic pack	Medline	DYNJP1000	Sterile drapes and table cover
Blood Collection Tubes- green top	Fisher Scientific	02-689-7	Collect microsphere blood samples
Blower Mister Kit	Medtronic/Covidien	22120	Clears surgical field for vessel anastomosis
BODIPY TR Ceramide	ThermoFisher Scientific	D7540
Bone marrow needle- 25mm 15 ga IO needle	Vidacare	9001-VC-005	Collect bone marrow
Bone Wax	Medline	ETHW31G	Hemostasis of cut bone
Bovie Cautery hand piece	Covidien	E2516	Hemostasis
Bupivicaine	Pfizer	00409-1161-01	Local Anesthetic
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Sigma Aldrich	B9275	Pre operative Analgesic for survivial procedures
Cell Scrapers	Corning	353085
Cephazolin 1 gr	Pfizer	00409-0805-01	Antibiotic
Chest Tube	Covidien	8888561043	Evacuates air from chest cavity
Cloroprep	Becton Dickenson	260815	Surgical skin prep
Corning bottle-top vacuum Filter System (500mL)	Millipore Sigma	430758
CPT tube	BD	362753	MSC isolation from bone marrow
Delrin Constrictor	U of MN	Custom made	Creates stenosis of LAD
Dermabond	Ethicon	DNX12	Skin adhesive
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium, HEPES	ThermoFisher Scientific	12430062
Dobutamine 12.5 mg/mL	Pfizer	00409-2344-01	Increases blood pressure and heart rate during the second microsphere blood collection
ECG Pads	DRE	1496	Monitor heart rhythm
Exosome-Depleted FBS	ThermoFisher Scientific	A2720801
Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets, Sterile, 10mL	Fisher Scientific	13-675-20
Femoral and carotid introducer	Cordis- J&J	504606P	femoral and carotis cannulas
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated, Gibco FBS	ThermoFisher Scientific	16140089
Flo-thru 1.0	Baxter	FT-12100	used to anastomos LIMA to L
Flo-thru 1.25	Baxter	FT-12125	FT-12125
Flo-thru 1.5	Baxter	FT-12150	FT-12150
Flo-thru 2.0	Baxter	FT-12200	FT-12200
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Hair Clipper	Oster	078566-011-002	Remove hair from surgery sites
Helistat collagen sponge	McKesson	570973 1690ZZ	Sponge for embedding exosomes
Heparin	Pfizer	0409-2720-03	anticoaggulant
Histology Jars	Fisher Scientific	316-154	Formalin for tissue samples
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH30071.03
Hypafix	BSN Medical	4210	Secure wound dressing and IV catheters
Isoflurane	Sigma Aldrich	CDS019936	General Anesthestic- Inhalant
IV Tubing for Blower Mister	Carefusion	42493E	Adapts to IV Fluids for Blower/Mister
Jelco 18 ga IV catheter	Smiths medical	4054	IV access in Revasc, MRI and Term
Lidocaine 2%	Pfizer	00409-4277-01	Local Anesthetic/ antiarrthymic
Ligaclips	Ethicon	MSC20	Surgical Staples for LIMA takedown
Long blade for laryngoscope	DRE	12521	Allows for visualization of trachea for intubation
Meloxicam 5 mg/mL	Boehringer Ingelheim	141-219	Post operative Analgesic
Microsphere pump			Collect blood samples from femoral introducer
Monopolar Cautery	Covidien	Valleylab™ FT10	Hemostasis
Nanosight NS 300	Malvern Panalytical	MAN0541-03-EN
NTA 3.1.54 software	Malvern Panalytical	MAN0520-01-EN-00
OPVAC Synergy II	Terumo Cardiovascular System	401-230	Heart positioner and Stabilizer
Oxygen Tank E cylinder	various	various	Used for Blower Mister if anesthesia machine doesn't have auxiliary flow meter
PBS, pH 7.2	ThermoFisher Scientific	20012050
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture	ThermoFisher Scientific	15640055
Pigtail 145 catheter 6 French	Boston Scientific	08641-41	Measure LV pressures
Pressure Transducer	various	Must adapt to anesthesia monitor	Monitor direct arterial pressures
Propofol	Diprivan	269-29	Induction agent
Roncuronium	Mylan	67457-228-05	Neuromuscular blocking agent
SR Buprenorphine 10 mg/mL	Abbott Labs	NADA 141-434	Post operative Analgesic
Sterile Saline 20 mL	Fisher Scientific	20T700220	Flush for IV catheters
Sternal Saw/ Necropsy Saw	Thermo Fisher	812822	Used to open chest cavity
Stop Cocks	Smith Medical	MX5311L	2 to connect to pig tail
Succinylcholine 20 mg/mL	Pfizer	00409-6629-02	Neuromuscular blocking agent
Suction  tubing	Medline	DYND50223
Suction Container	Medline	DYNDCL03000
Surgery pack with chest retractor	various	See pack list	Femoral cut down and median sternotomy
Surgical Instruments	various	See pack list	Femoral and carotid cutdowns and sternotomy
Surgical Spring Clip	Applied Medical	A1801	Clamp end of LIMA after takedown
Syringe pump	Harvard		Delivers IV Dobutamine infusion
SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO	Millipore Sigma	S32703
Telazol 100 mg/mL	Fort Dodge	01L60030	Pre operative Sedative
Telpha pad	Covidien	2132	Sterile wound dressing
Timer			Time collection of blood samples
Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media)	ThermoFisher Scientific	4478359
TPP Tissue Culture Flask, T75, Filter Cap w/ 0.22uM PTFE	ThermoFisher Scientific	TP90076
Triple Antibiotic Ointment	Johnson & Johnson	23734	Topical over wound
Vicryl mesh	Ethicon	VKML	Patch for epicardial cell application
Vortex			Mix microspheres
Xylazine 100 mg/mL	Vedco	468RX	Pre operative Sedative/ analgesic