使用间充质干细胞通过 体内 软骨内骨化进行整合骨形成

摘要

通过植入由间充质干细胞产生的人工软骨组织，通过软骨内骨化进行骨治疗有可能规避传统疗法的缺点。透明质酸水凝胶可有效扩大均匀分化的软骨移植物，并在 体内融合移植物之间形成具有血管化的整合骨。

摘要

使用间充质干细胞 （MSC） 的常规骨再生疗法很难应用于大于临界尺寸的骨缺损，因为它没有诱导血管生成的机制。植入由间充质干细胞制成的人造软骨组织通过软骨内骨化 （ECO） 在 体内 诱导血管生成和骨形成。因此，这种ECO介导的方法可能是未来一种很有前途的骨再生疗法。这种 ECO 介导的方法临床应用的一个重要方面是建立一个方案，用于准备足够的软骨以植入以修复骨缺损。设计大小符合实际骨缺损形状的单个移植软骨块尤其不切实际。因此，被移植的软骨必须具有多块植入时整体形成骨骼的特性。水凝胶可能是一种有吸引力的工具，用于扩大用于软骨内骨化的组织工程移植物以满足临床要求。尽管许多天然衍生的水凝胶在 体外 支持MSC软骨形成，在 体内支持ECO，但满足临床应用需求的最佳支架材料尚未确定。透明质酸（HA）是软骨细胞外基质的重要组成部分，是一种可生物降解和生物相容的多糖。在这里，我们表明HA水凝胶具有优异的特性，可以支持基于MSC的软骨组织的 体外 分化，并促进 体内软骨内骨的形成。

引言

自体骨仍然是修复因创伤、先天性缺损和手术切除引起的骨缺损的金标准。然而，自体骨移植具有显着的局限性，包括供体疼痛、感染风险和可从患者中分离出的骨量有限 1,2,3,4。许多生物材料已被开发为骨替代品，将天然或合成聚合物与矿化材料（如磷酸钙或羟基磷灰石）相结合 ^5,6。这些工程材料中的骨形成通常使用矿化材料作为启动材料来实现，以使干细胞通过膜内骨化 （IMO） 过程直接分化成成骨细胞⁷。该过程缺乏血管生成步骤，导致植入后移植物的体内血管化不足8,9,10，因此^，使用这种过程的方法可能不是治疗大骨缺损的最佳方法¹¹。

用于概括软骨内骨化 （ECO） 过程的策略已被证明可以克服与传统的基于 IMO 的方法相关的重大问....

研究方案

该方案使用4周龄的雄性裸鼠。在22-24°C和50%-70%相对湿度下，在12小时光/暗循环下将四只小鼠饲养在笼子中。所有动物实验均按照东京医科齿科大学机构动物护理和使用委员会批准的指南（批准编号：A2019-204C、A2020-116A 和 A2021-121A）进行。

1. 缓冲液和试剂的制备

1. 通过将MSC生长培养基的补充试剂盒添加到MSC基础培养基中来制备间充质干细胞生长培养基（MSC生长培养基），并将其储存在4°C。
2. 通过向培养基中加入10%胎牛血清（FBS），50μg/ mL庆大霉素，200μML-丙氨酰-L-谷氨酰胺和1ng / mL碱性成纤维细胞生长因子来制备Dulbecco改良的Eagle培养基和Ham's F12（DMEM / F-12）培养基，并将其储存在4°C。
3. 使用前向DMEM中加入1%ITS-G添加剂，0.12%牛血清白蛋白，50μg/ mL庆大霉素，0.35mM L-脯氨酸，100nM地塞米松和10ng / mL TGF-β3来制备软骨培养基。
4. 使用前向DMEM中加入10mM β-甘油磷酸盐，0.12%牛血清白蛋白，10nM地塞米松，200μM抗坏血酸-2-磷酸盐，50nM L-甲状腺素，50μg/ mL庆大霉素和50pg / mL IL-1β来制备肥厚培养基。
5. 用200μL在60°C预热的熔化石蜡涂覆24孔培养皿....

讨论

使用适当的支架材料来促进从肥厚软骨到骨骼的过渡，是扩大基于 MSC 的工程肥厚性软骨移植物和治疗具有临床意义的骨缺损的有前途的方法。在这里，我们表明 HA 是一种极好的支架材料，可在体外支持基于 MSC 的肥厚软骨组织的分化并促进体内软骨内骨形成 ³⁸。此外，在体内，HA构建体被证明可以促进植入同一口袋中的多个构建体的融合，以形成单个整合的.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
basic fibroblastic growth factor	Reprocell	RCHEOT002
bovine serum albumin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	012-23881	7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%	Invitrogen	C10283
dexamethasone	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Merck	D6429	high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Merck	D6421
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
Gentamicin sulfate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	1676045	10 mg/mL
Haccpper Generator	TechnoMax	CH-400-5QB	50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit	Merck	HYS020
IL-1ß	PeproTech	AF-200-01B
ITS-G supplement	FUJIFILM Wako Pure Chemical	090-06741	×100
L-Alanyl-L-Glutamine	FUJIFILM Wako Pure Chemical	016-21841	200mmol/L (×100)
L-proline	Nacalai Tesque	29001-42
L-Thyroxine	Merck	T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
paraffin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	165-13375
PBS / pH7.4 100ml	Medicago	09-2051-100
TGF-β3	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment	SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	048-34332