慢性非特异性腰痛大鼠模型的手法治疗

摘要

本研究提出了一种慢性腰痛模型大鼠手法治疗的标准化程序，对未来手法治疗的实验研究具有参考价值。

摘要

慢性腰痛 （CLBP） 是世界范围内非常普遍的疾病，也是导致残疾的主要原因。由于不明的病理原因，大多数 CLBP 患者被诊断为慢性非特异性腰痛 （CNLBP）。手法疗法 （MT） 是传统中医不可或缺的一个方面，在中国被公认为推拿。它涉及跌打和肌肉松弛作等技术。尽管 MT 在治疗 CNLBP 方面具有临床疗效，但 MT 的潜在机制仍不清楚。在旨在研究这些机制的动物实验中，主要挑战之一是在 CNLBP 模型大鼠上实现规范的 MT。提高手指强度的稳定性是 MT 的一个关键问题。为了解决这一技术限制，本研究提出了 CNLBP 模型大鼠 MT 的标准化程序。该程序显着增强了手部 MT 的稳定性，并缓解了在 MT 期间与固定大鼠相关的常见问题。本研究结果对未来 MT 的实验研究具有参考价值。

引言

慢性腰痛 （CLBP） 的特征是持续 3 个月以上的持续腰痛，通常在胸腔和髋横线之间，伴有或不伴有下肢疼痛 ^1,2。它是一种非常普遍的疾病，估计全球年患病率为 38%，终生患病率为 39%，使其成为常见的公共卫生问题 ^3,4。大多数 CLBP 患者（超过 90-95%）无法给出明确的病理和解剖学诊断（例如肿瘤、骨折和感染），导致被归类为慢性非特异性腰痛 （CNLBP）^5,6。由于病理机制的非特异性，阿片类镇痛药和非甾体抗炎药 （NSAID） 是西医的主要治疗选择，但与安全问题有关^，7,8。因此，对安全有效的补充和替代药物的需求不断增加。

手法疗法 （MT），在中国通常被称为推拿，是传统中医 （TCM） 的一个重要方面，包括跌打和肌肉松弛手法等技术。它在中国的广泛使用归因于其临床有效性、高安全性和无创性⁹。在治疗 CNLBP 时，已发现 MT 是一种有效的补充和替代药物，先前的研究已证实其疗效 10,11,12。中医认为气滞血瘀是慢性疼痛的核心原因，推拿通过促进血液循环和促进气到肌肉和软组织来缓解疼痛。然而，尽管其疗效良好，但其治疗效果的确切机制仍然难以捉摸。

在 MT 的实验研究领域，在动物模型上实施干预措施存在差异。目前，大多数研究人员选择基于机器的 MT，而少数研究人员使用人手进行 MT 13,14,15,16。虽然基于机器的 MT 更加标准化，但 MT 更具临床相关性，并产生更具代表性的数据。然而，实验动物的 MT 受到手指力量不稳定的阻碍，导致动物实验面临关键挑战，并阻碍了实验结果的可比性。为了克服这一技术挑战，本研究提出了一种合适的解决方案，以增强 CNLBP 模型大鼠 MT 期间手指强度的稳定性。该解决方案的可行性得到了验证，为未来的 MT 实验研究提供了有价值的指导。

研究方案

该实验方案得到了浙江中医药大学动物护理和使用委员会的批准，所有程序均符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南。该研究使用了体重为 330 g 至 350 g 的成年雄性 SD 大鼠（见 材料表）。将所有大鼠饲养在标准动物设施中，明暗循环为 12 小时，温度为 24 ± 2 °C，湿度为 50 ± 5%。为大鼠提供足够的食物和水供应。以下协议提供了 CNLBP 模型建立和手法治疗程序的详细说明。

1. 按照以下步骤建立腰痛模型（图 1）

1. 喂大鼠直到它们重 330-350 g，称重，然后腹膜内注射 3% 戊巴比妥钠 （1 mL/kg） 以麻醉它们（见 材料表）。等待 2 min，然后用镊子轻轻捏住后肢的四个脚趾，用镊子触摸大鼠的角膜，检查是否有回缩或眨眼反应，表明麻醉成功。
   注意：提前高压灭菌大鼠建模中使用的所有手术器械，并用酒精对其他不可高压灭菌的器械（如剃须刀、ELFS 设备和恒温台）进行消毒。作者应穿着干净的实验服、一次性无菌手套、口罩、外科帽和口罩。
2. 在大鼠的眼睛上涂抹适量的兽药膏，以防止麻醉后因长时间无法闭眼而干燥。
3. 将大鼠置于恒温台上的胸骨卧位，找到其 L4-6 段，剃掉该段的毛发并用 Iodophor 消毒 3 次，然后铺开一次性手术腔铺巾。
4. 用手术剪刀剪开 L4-6 段的皮肤和筋膜，然后用手术刀分离该段腰椎棘突两侧的肌肉。
   注意：确保肌肉与棘突完全分离，并且没有肌肉纤维仍然附着在棘突上。此外，分离深度应延伸到腰椎的横突。
5. 用 4 mL 注射器针头在 L6-6 的棘突中间钻一个孔，然后将外部链接固定系统 （ELFS）（见 材料表）加载到 L4-6 的棘突上。
6. 用碘伏消毒，然后在伤口的每一侧肌肉注射 100,000 单位青霉素（见 材料表）后缝合。
   注意： 缝合前向前推动 ELFS 装置以降低 ELFS 装置的高度，然后在皮下缝合以防止感染。
7. 在大鼠醒来之前拍摄 X 光片，以确定 ELFS 装置是否成功连接到 L4-6 棘突（图 2）。
   注意：拍完 X 光片后，将大鼠置于恒温台上的胸骨卧位（见 材料表），等到它醒来后，再将其放回笼子，在它醒来之前不要无人看管。
8. 如前所述¹⁷，将每只模型大鼠放在一个笼子里喂食 2 周，如果 ELFS 装置在 2 周结束时没有脱落，则认为 CNLBP 建模成功。
   注：术后恢复期，少数大鼠因感染导致腰部出现脓肿;在这种情况下，使用 2.5 mL 注射器吸出脓液，然后用生理盐水冲洗伤口，最后用棉球按压伤口几秒钟。
9. 为防止大鼠损坏彼此的 ELFS 设备，请在 2 周恢复期后继续将每只模型大鼠饲养在一个笼子中。
   注意：为防止单笼喂养引起的大鼠心理抑制，请在笼子中放置一个塑料球玩具（见 材料表）。

2. CNLBP 模型大鼠的手法治疗程序（图 3）

1. 在 MT 之前，在称重台上进行为期 2 周的手指力量稳定性练习（见 材料表）。在运动过程中，保持受控的手指揉捏力约为 600 克，频率为每秒 2 次。每天进行一次练习，每次持续 10 分钟。
2. 在 MT 之前，将模型大鼠适应大鼠袋 1 周。将大鼠的上半身放入袋子中，露出腰部和下肢。同时，轻轻抚摸大鼠的腰部区域，以鼓励它们接受手指与腰部区域的接触。
   注意：将一块布料的形状剪成顶角为 90°、半径为 12 厘米的扇形。然后，将扇形织物的两侧缝合在一起，制成鼠袋（见 补充图 S1）。
3. 将大鼠放入鼠袋中。这时，老鼠的上半身被鼠袋覆盖，只露出腰部和下肢。用非惯用手将大鼠的上半身保持在 “C ”形，同时用惯用手对大鼠的腰部区域进行 MT。
   注意：用非惯用手握住老鼠的躯干时，不要把老鼠的躯干握得太紧。如果老鼠被抱得太紧，老鼠的胸部会受到压缩，呼吸会受阻。它还会导致老鼠变得非常抵抗。
4. 找到嘉记 （EX-B2） 穴位的确切位置。首先，确定大鼠 L4-6 棘突的位置。嘉济穴位于 L4-6 两侧，距椎棘突 0.5 cm。一共有六个佳吉穴位。
   注意：在大鼠中，L6 的棘位于两个髂前上棘的线上，沿着 L6 的棘向上计数可以找到 L4 和 L5 的位置。
5. 将拇指放在大鼠 L4-6 段的佳记穴上，逐渐增加揉捏强度。当模型大鼠在安静状态下表现出肢体扭动、大声尖叫、强烈挣扎等抵抗行为时，当时的揉捏力为最大压力值。确保最合适的压力略小于最大压力值，这是大鼠可以承受的最大压力值，而不会表现出抵抗行为。
6. 从 L6 左侧的嘉吉穴开始。找到最适合大鼠贾吉穴的压力水平后，尽可能长时间地将拇指保持在该压力水平，同时以每秒 2 次的频率进行揉捏动作，持续一分钟。对其余 5 个佳记穴重复此作。
7. 如果在揉捏过程中观察到大鼠的抵抗行为，请停止拇指压力，直到大鼠平静下来，然后继续该过程。确保每个穴位的揉捏过程持续 1 分钟，即使过程中有中断。

3. 爪子退出阈值 （PWT）

1. 在正式测试之前，将大鼠放在金属丝网上的透明有机玻璃盒中 30 分钟，以使它们适应环境。
2. 使用不同大小的 von Frey 细丝 （0.6、1、2、4、6、8、15、26 g）（见 材料表），大鼠停止探索和梳理后，垂直刺激左后爪中部，缓慢增加压力直到细丝略微弯曲，然后停止压力并保持压力值 5 s。
   注意： 用细丝刺激后爪时，请避开后爪中间较厚的皮肤区域。
3. 如果大鼠表现出腿部后缩或反应，则将积极行为记录为 X ，并给予较低水平的刺激丝。将没有积极行为记录为 O 并给出更高水平的刺激丝。
   注意：两个相邻刺激之间的间隔应大于 30 秒。
4. 当 X 连续检测 4 次，然后获得连续的 X O 序列，然后根据 Chaplan¹⁸ 的方法将序列转换为相应的 PWT 值。

4. 爪子撤退潜伏期 （PWL）

1. 在正式测试之前，将大鼠置于 Hargreaves 装置（参见 材料表）中 30 分钟，以使它们适应环境。
2. 设置仪器参数如下： 最大曝光时间 20 s; 光暴露强度 50%（ 参见 补充图 S2）。
   注意：最大曝光时间不应超过 20 s，以免灼伤大鼠的爪子，从而影响后续检测值的准确性。
3. 在老鼠停止探索和梳理后，将热刺激器上的 + 与老鼠左后爪的中心对齐。单击 Start（开始），当大鼠表现出抬脚行为并且仪器自动停止计时时，记录结果时间值。对每只大鼠进行总共五次测试。
   注意：同一只大鼠每次测试之间的间隔至少为 5 分钟，以避免灼伤大鼠的后爪皮肤。
4. 从每只大鼠测量的五个值中删除最大值和最小值，并将其余三个值的平均值作为大鼠的 PWL 值。

5. 苏木精和伊红 （H&E） 染色

1. 在 MT 2 周结束时用戊巴比妥钠麻醉大鼠，并在完全麻醉后通过心脏灌注对所有大鼠实施安乐死。
2. 从大鼠 L5 中取出左腰大肌，并浸入 4% 多聚甲醛中（参见 材料表）固定 48 小时。
3. 将组织修剪到合适的大小并将其放入包埋盒中（参见 材料表），然后使用自动脱水器（参见 材料表）进行脱水。
4. 使用石蜡包埋组织，然后将组织切成 5 μm 厚的切片。
5. 将切片安装在载玻片上并烘烤 4 小时。
6. 将组织放入自动染色机中（参见 材料表）进行后续脱蜡、苏木精染色、分化、发蓝、伊红染色、脱水和透明度¹⁹。
7. 用中性树脂密封切片（参见 材料表），并在通风处放置 24 小时。
8. 使用数字载玻片扫描仪扫描载玻片（参见 材料表）。

结果

本研究旨在探讨 MT 对 CNLBP 模型大鼠的镇痛作用。为此，将 24 只大鼠随机分为 4 组，即空白组、假手术组、模型组和 MT 组，每组包含 6 只大鼠。空白组未接受任何干预，而假手术组仅接受手术作，其中 L4-6 棘突两侧的腰肌分离缝合，无需任何后续干预。按所述方法在模型组中建立 CNLBP 模型大鼠，无需任何进一步干预。在 MT 组中，CNLBP 模型大鼠在建模成功后接受 MT 治疗 2...

讨论

目前，对于准确复制慢性非特异性腰痛 （CNLBP） 的动物模型缺乏共识。存在多种 CNLBP 动物模型，例如椎间盘衍生、神经源性、骨关节衍生和肌肉衍生模型²³。然而，由于 CNLBP 在临床实践中的异质性，这些模型存在局限性。本研究中使用的 CNLBP 模型是从 Henderson 的“外部链接”模型²⁴ 修改而来的，该模型是骨关节衍生的 CNLBP 模型。在之...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Dehydrator	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Excelsior AS
Automatic Stainer	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Gemini AS
Constant temperature table	Harvard Bioscience (Shanghai) Co.,Ltd	50-1247	Heated small animal operating table usually operated at 37 °C–38 °C
Digital Slide Scanner	HAMAMATSU Co.,Ltd	C13210-01
External link fixation system	Shanghai Naturethink life science & Technology CO., Ltd	custom-made
Embedding box	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	31050102W
Hargreaves Apparatus	UGO BASILE Co.,Ltd	37370
Neutral Resin	ZSGB-BIO Co.,Ltd	ZLI-9555
Paraformaldehyde	Macklin Co.,Ltd	P804536
Penicillin	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co.,Ltd	ZSQ-100-160A
Plastic ball toys	Shanghai Huake Industrial Co., Ltd.	HK11029-35503
SD rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.,Ltd	SCXK (HU) 2022-0004	male, 330-350 g
Sodium pentobarbital	Hangzhou Dacheng Biotechnology Co., Ltd.	P3761
Von Frey filaments	Stoeltingco Co., Ltd.	NC12775
Weighing table	Shanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.	YP20002B