使用 Tile/SED/Array 接口在多路复用离子束成像显微镜上快速构建组织微阵列和平铺面积成像

摘要

多重离子束成像 （MIBI） 通常用于对组织微阵列和平铺的连续组织区域进行成像，但当前用于设置这些实验的软件很繁琐。tile/SED/array 界面是一种直观的交互式图形工具，旨在显著简化和加速 MIBI 运行设置。

摘要

多重离子束成像 （MIBI） 是新一代基于质谱的显微镜技术，可生成组织学组织中蛋白质表达的 40+ 重图像，从而能够详细剖析细胞表型和组织结构组织。当用户选择组织上的物理位置进行成像时，会出现操作中的一个关键瓶颈。随着 MIBI 实验的规模和复杂性的增加，制造商提供的界面和第三方工具在对大型组织微阵列和平铺组织区域进行成像时变得越来越笨拙。因此，开发了一个基于 Web 的交互式、所见即所得 （WYSIWYG） 图形界面层 - 平铺/SED/阵列界面 （TSAI） - 供用户使用熟悉且直观的鼠标手势（如拖放、单击和拖动和多边形绘制）设置成像位置。它根据现代 Web 浏览器中已经内置的 Web 标准编写，不需要安装外部程序、扩展或编译器。当前数百名 MIBI 用户感兴趣的是，该接口极大地简化和加速了大型复杂 MIBI 运行的设置。

引言

多重离子束成像 （MIBI） 是一种以高达 250 nm 的分辨率在组织学组织切片上同时对 40+ 蛋白质进行成像的技术 ^1,2,3。使用标有同位素纯元素金属的抗体对组织学组织切片进行染色后，MIBI 仪器执行二次离子质谱分析，以同时定量组织各个点的所有同位素，从而定量所有 40+ 抗原的表达。在数百万个点的网格中执行，生成的 40+ 重蛋白质表达图像能够描绘细胞边界和识别特定细胞类型，同时保留空间背景 1,2,3,4。该技术已被大约 20 个站点的数百名用户用于研究数十种组织类型的细胞组成、代谢特征和/或结构，作为检查对肿瘤的免疫反应、感染因子引起的组织炎症、痴呆的神经病理学和怀孕期间的免疫耐受的一部分 5,6,7,8,9^，10,11.

MIBI 仪器操作的一个关键瓶颈是设置视场 （FOV） - 200 x 200 μm² 至 800 x 800 μm² 的组织区域 - 用于成像。MIBI 一次对一个 FOV 进行成像，最高可达 800 x 800 μm²，因此成像更大的区域需要将多个 FOV 拼接在一起。对组织微阵列（例如， 图 1A 中的八个圆形组织）进行成像涉及放置间隔的多个 FOV。为了设置 FOV，制造商界面提供了 1） 载玻片的光学相机图像，带有大致对应于指定成像坐标的十字准线（图 1A）和 2） 显示坐标处准确区域的二次电子检测器 （SED） 图像，据报道精确到 0.1 μm 以内（图 1B）。首先，用户使用光学图像大致定位单个 FOV。由于图像分辨率仅为每像素约 60 μm，因此如果位置偏离两个像素（每个像素 2 像素 x 60 μm），则标准 400 μm FOV 将偏离 30%。因此，用户必须使用 SED 图像来微调位置 - 这是一个由十几个步骤组成的繁琐序列，涉及多个弹出窗口、在文本框中键入坐标、使用方向控制按钮缓慢地轻推 SED，甚至经常在纸上写下坐标（补充图 1）。必须对 100+ 核心组织微阵列 （TMA） 的每个点重复此过程。一些第三方工具可以帮助进行初始粗略定位¹².但是，他们仍然需要一些编程知识，并且最终定位仍然通过十几个步骤的过程来完成。相邻 FOV 的网格定位也非常麻烦，稍后会拼接成平铺的全景图像。

因此，开发显示单元/SED/阵列界面 （TSAI） 的目标是使用户能够使用直观的交互式图形界面快速定位大量 FOV。TSAI 由两个主要组件组成：1） 基于 Web 的图形用户界面 （Web UI），用于快速放置 TMA 点和组织平铺，以及 2） 集成到 MIBI 用户控制界面中，用于生成平铺的 SED 图像和调整 FOV 位置。如果仅使用光学图像，则可以粗略定位许多 FOV，然后使用 FOV 导航/调整工具快速调整（图 2，TSAI，左分支）。但是，如果执行 SED 平铺，则可以将 FOV 准确定位在平铺的 SED 图像上，而无需在 SED 模式下进一步调整（图 2，TSAI，右分支）。这些工具是数百名当前 MIBI 用户普遍感兴趣的，即使对于新手来说，这些工具也使平铺和 TMA 定位变得非常简单，并将复杂的 MIBI 运行设置从几个小时减少到几十分钟。

研究方案

1. TSAI 的加载

1. 通过在 MIBI 用户控制计算机的 Web 浏览器中打开 https://tsai.stanford.edu/research/mibi_tsai 来运行 TSAI。
   1. 此 TSAI 实例包含不适用于所有乐器的自定义预设。使用时，仅从模板 FOV 构建瓦片，如下面的步骤 2.6 中生成。TSAI 在 Web 浏览器中本地运行，不会将图像、.json或文件名数据发送到服务器或存储在服务器上。
2. 或者，在任何网站上为任何乐器设置自定义预设 TSAI。
   1. 转到 https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai 并下载 mibi_tsai_standalone 目录。或者，下载 Supplementary Coding File 1 .zip 文件，并将内容解压缩到名为 mibi_tsai_standalone 的目录中。
   2. 在任何文本编辑器中打开 mibi_tsai_standalone/_resources/index.js。
   3. 如有必要，请在 index.js 中编辑 FOV 大小、停留时间/定时选择、光栅大小、FOV JSON 和建议的预设设置，以匹配仪器的设置。这主要适用于定制仪器，但无论如何都应检查 dage time/timing 选择对。保存index.js。
   4. 将mibi_tsai_standalone上传到可通过 Internet 访问的任何 Web 服务器，例如实验室网站或大学托管的网站。
   5. 在 MIBI 用户控制计算机的 Web 浏览器中打开 mibi_tsai_standalone/index.html。

2. 加载 MIBI 幻灯片并创建模板文件

1. 在 Web 浏览器中登录 MIBI 实验跟踪器（制造商提供的用于管理扫描相关元数据的 Web 界面）。
2. 在 幻灯片 选项卡中，添加新幻灯片并添加新部分（补充图 2A-B）。在 “资源 ”选项卡中，选择或创建一个标记面板（补充图 2C）。
3. 在 “部分” 选项卡中，将新部分添加到面板（补充图 2D）。
4. 登录到 Web 浏览器中的 MIBI 用户控制界面。通过单击 交换样品 并选择新幻灯片来加载 MIBI 幻灯片（补充图 3A）。
5. 通过单击 添加 FOV （补充图 3B）并设置框架尺寸、FOV 大小、停留时间、成像模式和截面 ID 来创建模板 FOV。
6. 将 FOV 列表导出（下载）为 .json 文件（补充图 3C）。将光学图像下载为 .png 文件（补充图 3D）。

3. 光学像台电机共配准

1. 在 Web 浏览器中打开 TSAI Web UI。如果之前未执行过联合配准，则光学联合配准菜单应自动打开。如果已执行并且足够，请不要重复这些步骤。
2. 打开 Optical Coregistration 菜单。单击 将自动共同注册代码复制到剪贴板 （补充图 4A）。
3. 在 Web 浏览器中打开 MIBI 用户控制界面。按 Ctrl+Shift+J 打开浏览器控制台，或右键单击页面 并单击检查，然后打开 控制台 选项卡（补充图 4B）。
4. 将代码粘贴到控制台中，然后按 Enter。单击控制台中生成的链接（补充图 4C）。这会将共同注册加载到 TSAI Web UI 中，并将其保存为 Cookie，因此除非仪器硬件发生变化，否则它会持续存在，无需重复。

4. 平铺 SED 扫描

1. 将步骤 2.6 中的光学图像.png和.json文件拖放到 TSAI Web UI 上，加载它们。
2. 打开 SED Tiler 菜单，然后单击顶行中的文本框（补充图 5A）。
3. 单击（±拖动）光学图像以选择 SED 扫描的左上角（补充图 5B）。
4. 按 D 键或单击 SED Tiler 菜单中第二行中的文本框。
5. 单击（±拖动）光学图像以选择 SED 扫描的右下角。
6. 在 SED Tiler 菜单中，单击 Copy SED Scan and Shift Correction Code to Clipboard （补充图 5C）。
7. 在 Web 浏览器中打开 MIBI 用户控制界面。将代码粘贴到控制台中，然后按 Enter （补充图 5D）。
8. 在 QC - 300 μm 设置上将 MIBI 置于 SED 模式，移动到不会采集的区域，并调整增益、聚焦和柱头。
   1. 在不更改增益的情况下调整 SED 图像的亮度和对比度。按 B 可增加亮度，按 Shift+B 可降低亮度。按 C 可增加对比度，按 Shift+C 可降低对比度。按 Shift+V 可重置亮度和对比度。
9. 按 Shift+T 开始平铺 SED 扫描。
10. 完成后，它应该会自动保存平铺 SED 图像的新 .png 文件（图 3）。字符可以添加到文件名的开头，但不能修改文件名的任何其他部分。
11. 如果特定切片失焦或扫描不正确，请重新扫描它们。
    1. 按 Shift+R 将磁贴添加到重新扫描队列。将打开一个对话框，提示用户输入磁贴的行和列。这些数字的索引为零，因此输入 8,0 队列第九行，第一列。
    2. 将所有相关切片添加到队列后，按 Shift+T 重新扫描。完成后，它应自动保存平铺 SED 图像的新 .png 文件。
12. 关键步骤：检查平铺的 SED 扫描是否有较大的错位（图 3C-D）。如果存在，请联系制造商支持以调整电机和成像光束，或尝试使用步骤 4.12.1 至 4.12.9 中的键盘控件进行手动软件校正（补充图 6A）。
    1. 要检查 SED 载物台电机对齐，请移至载玻片上没有组织的区域。按 Shift+5 以棋盘格模式燃烧五个 400 μm FOV（补充图 6B-C），或按 Shift+9 以燃烧 400 μm FOV 的 3 x 3 模式（补充图 6D-E）。
    2. 如果 FOV 列相距太远，请按 1 并将 x f（x） 值设置为负十进制，通常介于 -0.0025 和 -0.1 之间。
    3. 如果第三行 FOV 相对于第一行 FOV 向左移动，请按 2 并将 x f（y） 值设置为正十进制，通常介于 0.0025 和 0.1 之间。
    4. 如果第三列 FOV 相对于第一列 FOV 向下移动，请按 3 并将 y f（x） 值设置为负十进制，通常介于 -0.0025 和 -0.1 之间。
    5. 如果 FOV 行相距太远，请按 4 并将 y f（y） 值设置为负十进制，通常介于 -0.0025 和 -0.1 之间。
    6. 迭代重复步骤 4.12.1 到 4.12.5，直到棋盘和 3 x 3 图案形成一个大致笔直的网格（补充图 6C、E）。
    7. 按 S 键可保存图案的.png图像，文件名中包含校正值。
    8. 将此 .png 文件拖放到 TSAI Web UI 上，以加载值并将其保存到浏览器 Cookie。
    9. 执行平铺 SED 扫描以检查系数。根据与步骤 4.12.2 到 4.12.5 中相同的原则，进一步调整系数以更正平铺 SED 图像中的任何错位。
13. 如果平铺的 SED 足够，请按 Esc 键。返回 TSAI Web UI。
14. 将平铺的 SED .png 文件拖放到 TSAI Web UI 上（补充图 5E）。
15. 单击 SED 选项卡并调整缩放（补充图 5F）。
16. 要调整图像亮度和对比度和/或绘制选项（如线条粗细和光标大小），请使用 SED 图像上方的滑动选项菜单。
17. 键盘快捷键可用，大多数显示在图像控件旁边：按 Z 键可放大，按 Shift+Z 键可缩小。按 B 可增加亮度，按 Shift+B 可降低亮度。按 C 可增加对比度，按 Shift+C 可降低对比度。按 Shift+V 可重置亮度和对比度。按 L 键切换图块上方的标签。按 O 可切换在焦点周围绘制的 5 mm 半径圆圈。

5. 组织微阵列 （TMA）

1. 如果为 TMA 光斑网格设置 FOV，请首先设置要复制的 FOV 图案。在 Tiles 列的相关图块中，调整列和行（图 4A）并选中/取消选中地图中的框（图 4B），以及根据需要调整其他 FOV 设置。
2. 在相关磁贴中，单击 TMA 以打开 TMA 选项菜单（图 4C）。设置 TMA 斑点的行数和列数（图 4D）。如有必要，添加命名前缀（图 4E）并编辑起始行和列编号（图 4F）。
3. 在幻灯片图像上，单击 TMA 的四个角（图 4G-J）。单击并拖动带圆圈的角以调整十字准线的位置，使其与 TMA 点最匹配。
4. 从 TMA 选项菜单中单击 构建 TMA （图 4K）。
5. 将鼠标悬停在 tiles 列中的每个图块上以检查其位置。要进行调整，请单击 移动 （图 4L）。然后单击并拖动幻灯片图像或按键盘箭头键。
   1. 按住 Shift 键的同时按箭头键可移动更远的距离。按住 Alt 键 （Windows） 或 Opt 键 （Mac） 的同时按箭头键可移动较短的距离。
   2. 选择移动后，按 T 取消选中图块名称旁边的复选框，将其从视图中删除，并在随后生成的任何.json文件中省略它。或者，直接用鼠标取消选中复选框（图 4M）或通过单击 删除将其完全删除。
   3. 选择移动时，按 2、4 或 8 将 FOV 大小分别设为 200 μm、400 μm 或 800 μm，栅格尺寸将按比例缩放，以使成像分辨率保持不变。
   4. 选择移动后，按 A 转到上一个图块，或按 D 转到下一个图块。
   5. 要调整其他磁贴设置，请单击 ≡ 按钮以展开设置菜单（如果它不可见）。

6. 区域/多边形瓦片

1. 如果将 FOV 设置为覆盖组织的连续区域，请首先根据需要在 Tiles 列的相关平铺中调整 FOV 设置。
2. 在相关磁贴中，单击 Polygon（图 5A）。单击幻灯片图像以设置要平铺的区域的顶点/角落（图 5B-C）。双击以关闭多边形并用 FOV 覆盖该区域（图 5D）。
3. 滚动到 Tiles 列的底部，然后单击新多边形瓦片中的 ≡ 按钮（展开时为 ^ ， 图 5E）以查看瓦片地图。
4. 通过单击瓦片地图（图 5F）或单击 Clicker （图 5G）并单击幻灯片图像中的平铺 FOV，打开或关闭单个瓦片。
5. 要关闭多个 FOV，请单击 Eraser ，然后单击并拖动幻灯片图像中的平铺 FOV（图 5H）。
6. 要打开多个 FOV，请单击 Clicker （图 5G），然后单击并拖动瓦片地图覆盖的幻灯片图像中的空白区域。
7. 要插入上面的行，请单击 ▲ 按钮（图 5I）。要在左侧插入列，请单击 ◄ 按钮（图 5J）。
8. 要调整平铺位置，请单击 移动 （图 5K）。然后单击并拖动幻灯片图像，按键盘 箭头键，或使用步骤 5.5.1 到 5.5.5 中描述的其他控件。

7. FOV 导航和调整

1. 如果 SED 平铺未对准或光学图像十字准线未反映实际载物台电机位置，请借助以下键盘控件在 MIBI 用户控制界面中调整 SED 模式下的 FOV 位置。
2. 打开幻灯片（光学或 SED）图像下方的 FOV 导航/调整菜单。单击 Copy FOV Navigation Code to Clipboard（将 FOV 导航代码复制到剪贴板）。
3. 在 Web 浏览器中打开 MIBI 用户控制界面。将 MIBI 置于 SED 模式并调整增益、焦点和标记。
4. 按 Ctrl+Shift+J 打开浏览器控制台，或右键单击页面并单击 Inspect，然后打开 Console 选项卡。
5. 将代码粘贴到控制台中，然后按 Enter。该代码将自动导航到第一个 FOV 和 MIBI 用户控制界面的 SED 图像中显示的确切 FOV 位置。
6. 在不更改增益的情况下调整 SED 图像的亮度和对比度。按 B 可增加亮度，按 Shift+B 可降低亮度。按 C 可增加对比度，按 Shift+C 可降低对比度。按 Shift+V 可重置亮度和对比度。
7. 要调整 SED 放大倍率，请按 M （200 μm）、 、（ 400 μm）、 . （800 μm） 或 / （最大）键。
8. 要移动 FOV，请按键盘 箭头 键。按 W 保存位置。按住 Shift 键的同时按箭头键可移动更远的距离。按住 Alt 键 （Windows） 或 Opt 键 （Mac） 的同时按箭头键可移动较短的距离。请注意，只有任何给定图块的 R1C1 可以移动。
9. 要打开或关闭 FOV，请按 T。要更改 FOV 大小，请按 2 （200 μm）、 4 （400 μm） 或 8 （800 μm）。栅格尺寸将按比例缩放，以使成像分辨率保持不变。
10. 要保存 SED 图像和叠加十字线的图像文件，请按 S 键。要将调整草稿存储到 .txt 文件，请按 X。
11. 满意后，按 D 可转到下一个 FOV，按 A 可返回上一个 FOV。对所有 FOV 重复步骤 7.6 到 7.11。
12. 完成所有 FOV 后，按 X 或 Escape。调整将保存到 .txt 文件并复制到剪贴板。
13. 返回 TSAI Web UI。将.txt文件拖放到 TSAI Web UI 上，或将调整粘贴到 FOV 导航/调整菜单中的文本框中。
14. 单击 Adjust 以将调整应用于 Tiles 列中的磁贴。

8. JSON 文件生成和导入

1. 在 Tiles 列下的 Output 下，检查磁贴列表和估计的运行时间（补充图 7A）。
2. 在“组”下，选择 FOV 分组选项（补充图 7B）。分组对按顺序排序的 .json 文件没有影响。
   1. 对于随机化的 .json 文件，按图块对 FOV 进行分组将对 FOV 进行排序，以便给定图块中的所有 FOV 保持在一起，即使图块的顺序是随机的。
   2. 对于随机化.json文件，请勿分组 FOV 将对 FOV 进行随机排序，以便来自不同图块的 FOV 混合在一起。
   3. 如果指定了运行中自动对焦，则 FOV 将自动按最近的自动对焦站点进行分组。
3. 在拆分下，选择拆分为多个.json文件的选项（补充图 7C）。
   1. Do not split （不分割） 会将所有 FOV 仅保存在一个 .json 文件中。
   2. 按每 # 个 FOV 分割 将 FOV 分割为多个 .json 文件，其中每个文件都包含指定数量的 FOV。
   3. 按每 # 小时 # 分钟拆分 会将 FOV 拆分为多个 .json 文件，其中每个文件的估计运行时间大致是指定的时间量。
4. 通过打开“重新排列”菜单（补充图 7D）来查看和重新排列 .json 文件中 FOV 的顺序。要移动 FOV，请单击并将其拖动到所需位置。其他 FOV 将围绕拖动的 FOV 交互式地重新排列。
5. 要保存 .json 文件，请单击 rearrange 菜单下方的 FOV 按钮。顺序.json将 FOV 按平铺、行和列排序（补充图 7E）。随机.json随机化步骤 8.2 中选择的组内的 FOV（补充图 7F）。
6. 要使用 FOV 和应用的显示选项（平铺标签、亮度、对比度等）保存组织图像，请单击 保存平铺图像 （补充图 7G）。这对于保存记录和与协作者共享通常很有用。
7. 返回 MIBI 用户控制界面。单击 Import FOVs 并选择生成的 .json 文件。根据需要调整焦点、耻辱和电流，然后单击 开始运行.

结果

TSAI 提供了两种设置 FOV 的方法（图 2）。一种仅使用光学图像（图 2，TSAI，左分支），类似于其他现有方法。第二种方法 - 生成平铺的 SED 图像 - 是 TSAI 独有的（图 2，TSAI，右分支）。TSAI 将 FOV 准确地绘制到此图像上，无需花费数小时在制造商界面 SED 模式下将 FOV 推到适当的位置。但是，必须正确设置 S...

讨论

多重离子束成像 （MIBI） 是一种用于剖析详细细胞表型和组织组织结构的强大技术 5,6,7,8,9,10,11。围绕 MIBI 的计算工作主要集中在成像后的数据处理上，但很少提高仪器软件在常见应用（如大型 TMA ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MIBI computer	Ionpath
MIBIcontrol (software)	Ionpath
MIBIscope	Ionpath		Multiplexed Ion Beam Imaging (MIBI) microscope
MIBIslide	Ionpath	567001	Conductive slide for MIBI
Tile/SED/Array Interface (TSAI) (software)		https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai/