角膜缘生态位细胞的分离和鉴定

摘要

在这里，我们提出了一种分离和鉴定人类角膜缘生态位细胞的方案。

摘要

在这里，我们报告了分离和鉴定角膜缘生态位细胞（LNC）的标准程序。从眼库获得的角膜缘组织用于LNCs分离。在无菌条件下将组织分成12块，并在37°C下在细胞培养箱中消化18小时，使用胶原酶A获得具有LNC和角膜缘上皮祖细胞的细胞簇。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37°C下进一步消化细胞簇15分钟以获得单细胞，然后在涂有5%基质凝胶的塑料表面上在改良的胚胎干细胞培养基（MESCM）中培养。细胞在 70% 汇合时传代，并使用免疫荧光、实时定量 PCR （qPCR） 和流式细胞术鉴定 LNC。原代 LNC 被分离并传代超过 12 次。从P4到P6的LNCs增殖活性最高。LNCs表达的干细胞标志物高于BMMSC（SCF、Nestin、Rex1、SSEA4、CD73、CD90、MSX1、P75NTR和PDGFRβ）。结果显示，P4 LNCs均均匀表达VIM、CD90、CD105和PDGFRβ，但不均匀表达Pan-CK，可作为LNCs鉴定的标志物。 流式细胞分析显示，约95%、97%、92%和11%的LNCs分别表达CD73、CD90、CD105和SCF，而在BMMSCs中分别表达68%、99%、20%和3%。LNCs分离鉴定的标准工艺可为LNCs的广泛应用提供可靠的实验室依据。

引言

角膜上皮干细胞缺乏症（CESD），也称为角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）¹，角膜上皮再生（CES）的发病率因角膜感染和损伤而变得越来越紧迫。如果治疗不当，CESD可能导致失明，需要角膜移植。因此，CES再生变得越来越重要。有一组称为角膜缘生态位细胞 （LNC） 的支持细胞为 CES 功能提供必要的支持。角膜缘基质干细胞首先由Polisetty等²分离，Xie等³鉴定为LNC，定位于角膜缘的角膜缘上皮和角膜缘的基质。LNCs是角膜边缘的关键支持干细胞，具有骨髓来源的MSCs（BMMSCs）的功能，可诱导发育成角膜上皮细胞和角膜基质细胞^等3,4,5,6,7。先前的研究表明，LNCs的干细胞质量比^BMMSCs8更原始，BMMSCs8已经在临床上被广泛使用。LNC甚至可能成为继MSC之后的下一个可行选择，特别是用于治疗CESD。作为CES的重要支持细胞，LNC也是源自角膜缘“生态位”结构的干细胞。LNC 可能在成熟角膜上皮细胞 （....

研究方案

年龄在50至60岁之间的供体的角膜缘组织来自同济医院（中国武汉）红十字眼库。该协议得到了同济伦理委员会的批准，并按照《赫尔辛基宣言》进行。

1. 隔离

1. 从中期角膜储存培养基中获取角膜缘组织，并在超洁净工作台上在无菌条件下操作。
2. 使用无菌手术圆刀片刮擦并去除角膜周围的虹膜和内皮。
3. 用手术刀片将角膜缘组织切成十二个大小相等的碎片，角膜和巩膜两侧留有 1 毫米。
4. 将角膜缘组织转移到 3.5 cm 培养板中，加入 1 mL 胶原酶 A（2 mg/mL，在 DF-12 培养基中），浸入所有组织进行消化。
5. 将板放入37°C细胞培养箱中，消化角膜缘组织18小时。
   注意：后续程序通常在第二天进行。
6. 准备5%基底膜基质（基质胶）包被的6孔培养板。
   1. 在孔的底部涂覆5%基底膜基质（溶解在MESCM [表1]中）。
   2. 在灭菌袋中准备 200 μL 和 1 mL 吸头、一个 15 mL 离心管和一个 6 孔板。
   3. 将灭菌袋（包括吸头和离心管）和新的6孔板置于-20°C或-80°C环境中20分钟。在4°C的冰箱中解冻基底膜基质。
   4. 从-20°C或-80°C环境中取出预冷的吸头、离心管和6孔板，然后在超净工作台上进行以下操作。
   ....

讨论

角膜透明度通常通过角膜基质中小纤维（直径 25-30 nm）的规则排列和分布来维持，这对于正常视力至关重要¹⁶。全世界有 2.53 亿视障者，其中 3600 万人是盲人¹⁷.世界卫生组织 （WHO） 认为角膜盲是人类视力最严重的危害之一，占全球所有失明的 5.1%¹⁶。CES正常的角膜上皮缺损可以快速愈合而不会留下疤痕¹⁸。据估计，全球有超过.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole	ThermoFisher	D1306	5μg/mL
Amphotericin B	Sigma	V900919	1.25 μg/mL
Anti-CD73	Abcam	ab202122	1:50
Bovine Serum Albumin	MERCK	A1933	-
CD105	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90	Proteintech	66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
Cell Incubator	Shanghai Lishen	K1119K4644	HF90(HT)
Centrifuge system	StatSpin	StatSpin CytoFuge 12	-
Collagenase A	Roche	10103578001	2 mg/mL
Confocal microscope	Zeiss	LSM700	-
Culture plate	virya	3500356	35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)	cytiva	SH30023.01	90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A16016	1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Diva sofware	BD Biosciences	Tree Star	-
Flow Cytometer	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	-
Fluorescence microscope	olympus	cx31
Gentamicin	Sigma	G1914	50 μg/mL
Hemocytometer	MERCK	Z359629	Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit	ThermoFisher	4374966
Inverted phase-contrast microscope	UOP	DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite)	Sigma	I3146	5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs	gibco	10828-028	10%
Matrigel	BioCoat	356234	-
Pan-CK	Abcam	ab7753	1:1000
Paraformaldehyde	NoninBio	NBS0135	4.00%
Paraformaldehyde	MKBio	MM-1505	4%
PDGFRβ	Abclonal	A1444	1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument	Applied Biosystems	Step One Plus	-
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit	Qiagen	74104	-
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
Stereomicroscope	ZEISS	SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade	Careforde	29500	size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix	Applied Biosystems	4448489
Triton X-100	MERCK	X100	0.20%
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	0.40%
Trypsin-EDTA	Genview	GP3108	0.25%
Tween 20	MERCK	P9416	-
Ultra Clean Bench	LaiTe	LT20200705	SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Vim	Abcam	ab92547	1:100