角膜缘生态位细胞的分离和鉴定

摘要

在这里，我们提出了一种分离和鉴定人类角膜缘生态位细胞的方案。

摘要

在这里，我们报告了分离和鉴定角膜缘生态位细胞（LNC）的标准程序。从眼库获得的角膜缘组织用于LNCs分离。在无菌条件下将组织分成12块，并在37°C下在细胞培养箱中消化18小时，使用胶原酶A获得具有LNC和角膜缘上皮祖细胞的细胞簇。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37°C下进一步消化细胞簇15分钟以获得单细胞，然后在涂有5%基质凝胶的塑料表面上在改良的胚胎干细胞培养基（MESCM）中培养。细胞在 70% 汇合时传代，并使用免疫荧光、实时定量 PCR （qPCR） 和流式细胞术鉴定 LNC。原代 LNC 被分离并传代超过 12 次。从P4到P6的LNCs增殖活性最高。LNCs表达的干细胞标志物高于BMMSC（SCF、Nestin、Rex1、SSEA4、CD73、CD90、MSX1、P75NTR和PDGFRβ）。结果显示，P4 LNCs均均匀表达VIM、CD90、CD105和PDGFRβ，但不均匀表达Pan-CK，可作为LNCs鉴定的标志物。 流式细胞分析显示，约95%、97%、92%和11%的LNCs分别表达CD73、CD90、CD105和SCF，而在BMMSCs中分别表达68%、99%、20%和3%。LNCs分离鉴定的标准工艺可为LNCs的广泛应用提供可靠的实验室依据。

引言

角膜上皮干细胞缺乏症（CESD），也称为角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）¹，角膜上皮再生（CES）的发病率因角膜感染和损伤而变得越来越紧迫。如果治疗不当，CESD可能导致失明，需要角膜移植。因此，CES再生变得越来越重要。有一组称为角膜缘生态位细胞 （LNC） 的支持细胞为 CES 功能提供必要的支持。角膜缘基质干细胞首先由Polisetty等²分离，Xie等³鉴定为LNC，定位于角膜缘的角膜缘上皮和角膜缘的基质。LNCs是角膜边缘的关键支持干细胞，具有骨髓来源的MSCs（BMMSCs）的功能，可诱导发育成角膜上皮细胞和角膜基质细胞^等3,4,5,6,7。先前的研究表明，LNCs的干细胞质量比^BMMSCs8更原始，BMMSCs8已经在临床上被广泛使用。LNC甚至可能成为继MSC之后的下一个可行选择，特别是用于治疗CESD。作为CES的重要支持细胞，LNC也是源自角膜缘“生态位”结构的干细胞。LNC 可能在成熟角膜上皮细胞 （MCEC） 向 CES⁹ 的去分化中发挥关键作用。然而，对LNCs的研究仍然相对不足，对LNCs的术语、分离、纯化、鉴定和特性尚未达成共识。一些研究人员将 LNC 命名为角膜缘活检来源的基质干细胞¹⁰、角膜缘间充质干细胞¹¹、角膜缘成纤维细胞干细胞 12 和角膜缘间充质基质细胞¹³。由于LNCs的生长特性尚未详细描述，且由于其科学和临床应用前景广阔，并且可能是未来最重要的临床工具之一，因此有必要总结LNCs的分离、纯化、鉴定和特性。

根据先前的一项研究^14，LNC主要存在于角膜缘上皮下和角膜缘的基质中。该方案包括使用胶原酶A处理角膜缘组织，获得由LEPC和LNC组成的簇，并将其消化成含有0.25%胰蛋白酶-EDTA（TE）的单细胞。然后将LNCs选择性地培养在改良的胚胎干细胞培养基（MESCM）中进行纯化。本文报道的方案简单，在大量获得人LNCs方面具有很高的效率。

视频中记录了LNC分离、培养和鉴定的详细过程，供对LNC研究感兴趣的科学家使用，必要时可以方便地重复。

研究方案

年龄在50至60岁之间的供体的角膜缘组织来自同济医院（中国武汉）红十字眼库。该协议得到了同济伦理委员会的批准，并按照《赫尔辛基宣言》进行。

1. 隔离

1. 从中期角膜储存培养基中获取角膜缘组织，并在超洁净工作台上在无菌条件下操作。
2. 使用无菌手术圆刀片刮擦并去除角膜周围的虹膜和内皮。
3. 用手术刀片将角膜缘组织切成十二个大小相等的碎片，角膜和巩膜两侧留有 1 毫米。
4. 将角膜缘组织转移到 3.5 cm 培养板中，加入 1 mL 胶原酶 A（2 mg/mL，在 DF-12 培养基中），浸入所有组织进行消化。
5. 将板放入37°C细胞培养箱中，消化角膜缘组织18小时。
   注意：后续程序通常在第二天进行。
6. 准备5%基底膜基质（基质胶）包被的6孔培养板。
   1. 在孔的底部涂覆5%基底膜基质（溶解在MESCM [表1]中）。
   2. 在灭菌袋中准备 200 μL 和 1 mL 吸头、一个 15 mL 离心管和一个 6 孔板。
   3. 将灭菌袋（包括吸头和离心管）和新的6孔板置于-20°C或-80°C环境中20分钟。在4°C的冰箱中解冻基底膜基质。
   4. 从-20°C或-80°C环境中取出预冷的吸头、离心管和6孔板，然后在超净工作台上进行以下操作。
   5. 使用 200 μL 吸头将 50 μL 5% 基底膜基质转移到 1 mL MESCM 中，并轻轻均匀地混合。
   6. 使用预冷的 1 mL 吸头将 5% 基底膜基质（溶解在 MESCM 中）转移到 6 孔培养板的一个孔中。
   7. 轻轻水平摇动6孔板，将6孔培养板置于37°C细胞培养箱中约1小时，然后进行下一步。
7. 消化18小时后，取出胶原酶A消化的角膜缘组织，只剩下一些可见的小簇和未消化的巩膜组织。
   注：高倍率显微镜揭示了一个由许多密集堆积的细胞（包括LNC）组成的簇。
8. 使用200μL移液器吸头在立体显微镜下从未消化的巩膜组织中分离簇。
9. 将簇转移到3.5cm培养板中，并将它们浸入0.25%TE中，然后将板置于细胞培养箱中15分钟。
10. 加入 1 mL MESCM 和 10% 敲除血清以停止细胞消化，并使用 1 mL 移液器吸头轻轻上下移液以将簇重悬到单个细胞中。
11. 将细胞悬液转移到 15 mL 离心管中，并以 200 x g 离心 5 分钟。
12. 小心地除去上清液，不要干扰细胞沉淀，然后加入 1 mL MESCM 以重悬细胞。
13. 上下移液2-3次，直至底部细胞沉淀均匀悬浮于MESCM中，使用1mL移液器吸头，取20μL细胞悬液进行细胞计数。
14. 用 1 mL 移液器吸头将细胞悬液转移到 5% 基底膜基质包被的 6 孔板中，并将 MESCM 的体积增加到 2.5 mL。
15. 水平轻轻摇动 6 孔板以均匀分布细胞。
16. 成像和记录后将细胞转移到培养箱中。每天观察和拍摄细胞，每3-4天更换一次培养基。

2. LNC的鉴定

1. 免疫荧光染色
   1. 在 37°C 细胞培养箱中使用 1 mL 0.25% TE 消化板底部的 LNC 5 分钟。
   2. 通过加入 1 mL MESCM（含有敲除血清）终止消化，将细胞悬液以 200 x g 离心 5 分钟，并小心吸出上清液。
   3. 加入 1 mL MESCM 以重悬悬于悬浮液中的细胞。为 4 张载玻片（20 μL/载玻片）制备 80 μL 细胞悬液（每张载玻片 4 ×^{10 个 3 个} 细胞），并按照制造商的说明使用离心机系统将细胞沉积到显微镜载玻片上。
   4. 使用4%多聚甲醛固定细胞（在步骤3中粘附在载玻片上）约10分钟，然后用0.2%Triton X-100在PBS中透化载玻片上的细胞15分钟。
   5. 用2%牛血清白蛋白（BSA）封闭细胞1小时，然后将它们与一抗（Pan-CK [1：1000]，Vim [1：100]，CD90 [1：100]，CD105 [1：200]，SCF [1：100]，PDGFRβ [1：100]）在振荡器上在4°C下孵育过夜。 孵育后，通过用PBST（PBS + 0.1%吐温20）洗涤（5分钟/洗涤，3x）载玻片除去未结合的一抗。
   6. 将相应的二抗（驴抗小鼠 IgG 二抗 TRITC [1：1000]、驴抗兔 IgG FITC [1：500]、驴抗小鼠 IgG 488 [1：300]、驴抗兔 IgG 594 [1：400]）与合适的 IgG 非特异性 IgG 抗体孵育 1 小时。使用PBST（5分钟/洗涤，3x）除去未结合的二抗。
   7. 用 5 μg/mL DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）对细胞核进行复染并密封载玻片。
   8. 使用荧光显微镜（放大倍率：400倍;曝光时间：50 毫秒）。
2. 实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）
   1. 按照制造商的说明，使用RNA分离试剂盒提取总RNA。
   2. 使用高容量 cDNA 转录试剂盒将 1-2 μg 总 RNA 逆转录为 cDNA。
   3. 在含有cDNA（100ng），TaqMan基因表达检测试剂盒（1μL），通用PCR预混液（10μL）和ddH 2O（至20μL）的_20μL溶液中进行逆转录（42°C，2分钟;50°C，85分钟）和qPCR（95°C，5分钟;95°C，10秒，40个循环）。
   4. 使用比较 CT 技术 （ΔΔCT）^4,9 检查相对基因表达。

3. LNC的表征

1. 细胞计数（血细胞计数器）
   1. 在37°C细胞培养箱中使用0.25%TE从板底部消化LNC5分钟。
   2. 通过加入 1 mL MESCM（含有敲除血清）终止消化，将细胞悬液以 200 x g 离心 5 分钟，并小心吸出上清液。
   3. 加入 1 mL MESCM 以重悬细胞，然后在 0.5 mL 离心管中取 10 μL 细胞悬液。加入等体积的0.4%台盼蓝染色液。
   4. 将 10 μL 染色的细胞悬液放在血细胞计数器的计数区域，并用盖玻片盖住进行计数。
      注意：五个中间正方形区域中的单元格数定义为“A”;1mL中的细胞数计算为5A×10,4×2。
2. 使用流式细胞术检查 LNC 和 BMMSC 标志物¹⁵
   1. 使用流式细胞术¹⁵ 检测 LNC 和 BMMSC 中 SCF、CD73、CD90 和 CD105 的表达（2-4 ×^{10 6} 个事件/样品，从每个样品中获得 2,000 个细胞，总共 550,000 个同时设门的细胞）。
   2. 根据试剂盒说明，使用预标记抗体（SCF [1：50]、CD70 [1：50]、CD90 [1：50]和CD105 [1：50]）在封闭缓冲液（3%BSA和0.05%吐温-20的PBS）中收集和染色细胞15分钟。
   3. 使用流式细胞仪进行荧光激活细胞分选 （FACS） 分析。在这项研究中，使用了 FACS Diva 软件和 FlowJo 软件。对于每个样品，记录 10,000 个事件并设门并分析活细胞。

结果

LNC的成长
如上所述，根据胶原酶A（2mg / mL）消化角膜巩膜边缘组织的酶切方法成功分离LNC（图1）。与先前报道的研究³一致，在胶原酶A消化后，在显微镜下观察到毛毛虫样簇（图2）。纺锤体细胞的比例随着细胞传代而逐渐增加。纺锤形细胞可以在包被的 5% 基底膜基质板上生长，这与在没有包被基底膜基质

讨论

角膜透明度通常通过角膜基质中小纤维（直径 25-30 nm）的规则排列和分布来维持，这对于正常视力至关重要¹⁶。全世界有 2.53 亿视障者，其中 3600 万人是盲人¹⁷.世界卫生组织 （WHO） 认为角膜盲是人类视力最严重的危害之一，占全球所有失明的 5.1%¹⁶。CES正常的角膜上皮缺损可以快速愈合而不会留下疤痕¹⁸。据估计，全球有超过...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole	ThermoFisher	D1306	5μg/mL
Amphotericin B	Sigma	V900919	1.25 μg/mL
Anti-CD73	Abcam	ab202122	1:50
Bovine Serum Albumin	MERCK	A1933	-
CD105	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90	Proteintech	66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
Cell Incubator	Shanghai Lishen	K1119K4644	HF90(HT)
Centrifuge system	StatSpin	StatSpin CytoFuge 12	-
Collagenase A	Roche	10103578001	2 mg/mL
Confocal microscope	Zeiss	LSM700	-
Culture plate	virya	3500356	35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)	cytiva	SH30023.01	90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A16016	1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Diva sofware	BD Biosciences	Tree Star	-
Flow Cytometer	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	-
Fluorescence microscope	olympus	cx31
Gentamicin	Sigma	G1914	50 μg/mL
Hemocytometer	MERCK	Z359629	Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit	ThermoFisher	4374966
Inverted phase-contrast microscope	UOP	DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite)	Sigma	I3146	5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs	gibco	10828-028	10%
Matrigel	BioCoat	356234	-
Pan-CK	Abcam	ab7753	1:1000
Paraformaldehyde	NoninBio	NBS0135	4.00%
Paraformaldehyde	MKBio	MM-1505	4%
PDGFRβ	Abclonal	A1444	1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument	Applied Biosystems	Step One Plus	-
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit	Qiagen	74104	-
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
Stereomicroscope	ZEISS	SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade	Careforde	29500	size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix	Applied Biosystems	4448489
Triton X-100	MERCK	X100	0.20%
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	0.40%
Trypsin-EDTA	Genview	GP3108	0.25%
Tween 20	MERCK	P9416	-
Ultra Clean Bench	LaiTe	LT20200705	SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Vim	Abcam	ab92547	1:100