使用高分辨率呼吸测量法分析 果蝇黑腹 果蝇 PINK1B9-Null 突变体的线粒体功能

摘要

在这里，我们提出了一种高分辨率呼吸测量方案，用于分析 PINK1^B9-null 突变果蝇的生物能量学。该方法使用底物-解偶联剂-抑制剂滴定 （SUIT） 方案。

摘要

神经退行性疾病，包括帕金森病 （PD），和细胞紊乱，如癌症，是一些破坏能量代谢并损害线粒体功能的疾病。线粒体是控制能量代谢和细胞存活和死亡的细胞过程的细胞器。出于这个原因，评估线粒体功能的方法可以为病理和生理过程中的细胞状况提供重要的见解。在这方面，高分辨率呼吸测量 （HRR） 方案允许评估整个线粒体呼吸链功能或特定线粒体复合物的活性。此外，研究线粒体生理学和生物能量学需要遗传和实验上可处理的模型，例如 果蝇黑腹果蝇。

该模型具有多种优点，例如与人体生理学的相似性、生命周期快、易于维护、成本效益高、高通量能力以及将伦理问题降至最低。这些属性共同确立了它作为解剖复杂细胞过程的宝贵工具。本工作解释了如何使用 果蝇黑腹 果蝇 PINK1^B9-null 突变体分析线粒体功能。 pink1 基因负责编码 PTEN 诱导的推定激酶 1，通过一个被认为是线粒体自噬的过程，这对于从线粒体网络中去除功能失调的线粒体至关重要。该基因的突变与常染色体隐性遗传性早发性家族性 PD 有关。该模型可用于研究与帕金森病病理生理学有关的线粒体功能障碍。

引言

线粒体是控制重要功能的细胞器，包括细胞凋亡调节、钙稳态和参与生物合成途径。通过拥有自主的遗传物质，它们能够为细胞维持和修复过程做出贡献。它们的结构包含电子传递链和氧化磷酸化，这两者都对细胞能量至关重要 ^1,2,3。特别是，能量控制是通过氧化磷酸化 （OXPHOS） 产生三磷酸腺苷 （ATP） ^来实现的2。能量代谢紊乱伴线粒体功能受损发生在细胞存活和死亡中 ^4,5，通常与多种人类病理学（如癌症）和神经退行性疾病（如帕金森病 （PD）^3,6）有关。

帕金森病是一种慢性、进行性和神经系统疾病。这种疾病的主要原因是脑细胞的死亡，特别是在黑质中，黑质负责产生控制运动的神经递质多巴胺 ^6,7,8。最早将帕金森综合征与线粒体功能障碍联系起来的....

研究方案

我们使用了来自布卢明顿果蝇种群中心（ID号：34749）的菌株w¹¹¹⁸（白色）和w[*] Pink1[B9]/FM7i，P{w[+mC]=ActGFP}JMR3（称为Pink1^B9）（FlyBase ID：FBgn0029891）。在这项研究中，将雄性黑腹果蝇PINK1^B9-null突变体与来自w¹¹¹⁸菌株的雄性黑腹果蝇进行比较，后者用作对照组（遗传背景）。其他参数必须与呼吸测量实验同时进行分析，以确保果蝇具有正确的基因型（Pink1^B9/Y），例如胸部畸形和运动问题，这些在pink1^B9突变果蝇^24,25,26中得到了很好的描述。

1. 动物和住房

1. 将苍蝇保存在含有10mL标准饮食（酵母1.73%，大豆粉0.9%，玉米粉7.3%，琼脂0.5%，玉米糖浆7.6%和丙酸0.48%）的玻璃瓶中，温度和湿度恒定（分别为25°C和60%），光/暗循环为12小时：12小时。
2. 对于每个实验，使用两只苍蝇在闭合....

结果

在这里，我们发现，与对照果蝇相比，PINK1 B9 无效果蝇在 PINK1^B9 无效果蝇中，OXPHOS CI （P = 0.0341） 和 OXPHOS CI&II （P = 0.0392） 状态下的 O₂ 通量降低（图 4）。这一结果在我们小组^29,30 的先前研究结果中也观察到。

CI 和 CII 是电子传输系统 （ETS） 的关键组成部分，其中 CI 负?.......

讨论

HRR 是一种强大的技术，用于研究 黑腹果蝇 和其他生物体的线粒体呼吸和能量代谢。它提供了对线粒体功能的详细和定量评估，使研究人员能够深入了解细胞的生物能量学。此处介绍的方案描述了使用SUIT协议在 黑腹果蝇中评估线粒体呼吸链功能和特定线粒体复合物的活性。SUIT方案涉及系统地操纵各种底物、解偶联剂和抑制剂，以检查线粒体呼吸的不同方面。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma-Aldrich	A5285	Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol.
Ágar	Kasv	K25-1800	For bacteriologal use
Antimycin-A	Sigma-Aldrich	A8674	Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight  540 g/mol;
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Datlab software	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20700	Software for data acquisition and analysis
Digitonin	Sigma-Aldrich	D 5628	CAS number 11024-24-1
Distilled water
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3			Obtained from Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster strain w1118			Obtained  from the Federal University of Santa Maria
EGTA	Sigma-Aldrich	E8145	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920	Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone  (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder
GraphPad Prism version 8.0.1.			Software for data acquisition and analysis
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol
High-resolution respirometer Oxygraph O2K	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	10022-02	Startup O2K respirometer kit
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379	Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol
KOH	Sigma-Aldrich	211473	Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets
Malate	Sigma-Aldrich	M1296	Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
Malic acid	Sigma-Aldrich	M1000	(S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol
MES	Sigma-Aldrich	M3671	2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol
Microcentrifuge tubes	Eppendorf
O2K-Titration Set	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20820-03	Hamilton syringes with different volumes
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O 4876	Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number  1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC)
Pistil to homogenization
Proline	Sigma-Aldrich	P0380	L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol
Succinate	Sigma-Aldrich	S 2378	Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99%
Sucrose	Merck	107,651,000	Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1)
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	CAS number 107-35-7