壮药药用线灸疗法及其在原发性痛经冷凝证大鼠模型中的应用

摘要

本文演示了壮药线艾灸在实验动物中的标准化操作流程。为了实现壮药线艾灸的可重复性和准确性，我们开发了一种模拟器来保持强度、热量和频率。我们构建了一个痛经模型，用于冷凝综合征大鼠的实验验证。

摘要

壮药线灸疗法是国家级非物质文化遗产之一。这是一种壮医特色疗法，涉及点燃浸泡在壮药制剂溶液中的苎麻线，直接对某个穴位或体表的某个部位进行艾灸。这种治疗方法的特点是药物、穴位、艾灸相结合，通过艾灸的温热刺激皮肤在穴位的受体，影响组织细胞的生化代谢和神经系统的功能，使药物成分经皮肤吸收。但壮药一线艾灸的治疗效果受艾灸强度、热强度、艾灸频率等因素的影响。手动操作无法精确控制每个影响因素。在这里，我们设计了一台壮药线艾灸模拟仪，以保持恒定的力、热量和频率。频率和热量可根据实验需要进行调整，可应用于镇痛实验的研究，观察壮药线艾灸对疼痛动物模型的镇痛效果，解决实验动物操作过程中壮药线艾灸的标准化问题。本研究建立了冷凝综合征大鼠原发性痛经模型，并详细介绍了壮药线灸对冷凝综合征大鼠原发性痛经模型的制备、工艺及注意事项。通过扭转评分和红外热成像体表温度检测评价壮药线灸对冷凝综合征大鼠原发性痛经的干预，直观地证明了庄药线灸的治疗效果，并对其作用机制进行了初步分析。

引言

壮药线灸疗法是以壮药理论为指导的一种独特的外治方法，利用苎麻线浸泡在各种壮药配制液中。取出后，苎麻线的一端在灯上点燃，形成珠状的木炭火花，然后迅速直接燃烧到某个穴位或人体表面的一部分，以防治疾病¹。这种疗法可以治疗临床实践中的各种疾病和症状，尤其是慢性疼痛、老年病、失眠、哮喘、风湿病等慢性病。在临床实践中，许多研究人员进行了广泛的理论讨论，并进行了严格的临床对照研究，以优化他们的操作技术并解释它们的作用机制^2,3,4。由于人体实验材料的局限性，壮药线灸的作用机制需要通过动物实验进一步验证。但壮药一线艾灸的治疗效果受艾灸强度、热强度、艾灸频率等因素的影响。手动操作无法精确控制每个影响因素。因此，需要设计一种仪器来保持壮药线艾灸的影响因素，这是未来实验研究的方向。

本文设计了一种壮药线艾灸模拟仪，以保持恒定的力、热量和频率。频率和热量可根据实验需要进行调整，可应用于镇痛实验的研究，观察壮药线艾灸对疼痛动物模型的镇痛效果，解决实验动物操作过程中壮药线艾灸的标准化问题。

壮药线艾灸模拟器设计原理
为使该领域的技术人员更好地理解壮药线艾灸模拟器的技术方案，下面结合 图1对本仪器进行详细说明。壮药线灸模拟器包括底座 （1）、支撑装置 （2）、药线控制装置 （3）、点火装置 （4） 和定位器 （5）。底座整体为矩形结构，顶面为手术台。支撑装置包括垂直轴和水平轴，在垂直轴和水平轴上分别具有用于垂直和水平移动的插槽。药线控制装置包括外壳、夹紧推料组件、药线、进料按钮和推进电机。夹紧-推动组件和药线设置在外壳内部，进料按钮设置在外壳的外表面，进料按钮被控制并连接到夹紧-推动组件。推进电机安装在底座内部。点火装置包括点火支撑轴、点火器、电线、点火按钮和速度控制按钮。点火器安装在点火支撑轴上，点火支撑轴垂直设置在操作台上。点火器通过电线连接到设置在底座侧面的速度控制按钮和点火器表面设置的点火按钮。所述定位仪包括定位杆轴和定位环，所述定位环设置在所述定位杆轴的末端，所述定位杆轴还可以进行竖直移动。点火支撑轴和定位杆轴均为“L”形伸缩杆结构，底座侧面还装有电源开关和电源指示灯。

原发性痛经 （PD） 作为青少年女性常见的妇科疾病之一，虽然没有器质性疾病，但发病率高，危害大⁵。相关文献的调查结果显示，不同国家的原发性痛经患病率从 45% 到 90%^不等6。其他研究发现，原发性痛经可能与前列腺素和白细胞介素的变化有关。这些因素水平升高会导致子宫平滑肌收缩、痉挛和子宫血流量减少 ^7,8。在以往的临床研究中，已经发现冷凝综合征占原发性痛经患者总数的一半以上。目前，冷凝综合征相关痛经的建模方法包括冰冷刺激、冰水浸泡用药、低温冰箱、冷风环境、局部肢体低温冻结法模拟临床冷凝综合征。原发性痛经患者常因外部寒冷而出现全身性冷凝和血瘀，疼痛由梗阻引起。因此，我们选择了冰冷刺激法。痛经模型是使用公认的苯甲酸雌二醇和催产素⁹ 的组合建立的。作为壮医最具特色的疗法之一，壮医线灸疗法在广西地区广泛传播。其对原发性痛经，尤其是冷凝综合征患者的治疗效果显著，但作用机制尚不清楚。本文观察壮药线灸疗法对冷凝型痛经大鼠子宫区域扭转实验和红外热成像的影响，探讨壮药线灸治疗冷凝型痛经的可能机制。

研究方案

本研究中的动物实验由广西中医药大学动物实验伦理委员会（伦理许可证号 DW20230411-45）审核通过。动物操作规程严格遵循《关于治疗实验动物的指导意见》（国科发财字〔2006〕398号）和国际疼痛研究学会（IASP）的动物保护使用标准的内容。

注意：本研究使用 SPF 级雌性大鼠，6 周龄，体重为 200 g ± 20 g。根据阴道涂片选择发情期大鼠，采用随机数法分为 4 组。分为载体组、冷凝型痛经模型组（模型组）、冷凝型痛经模型组+西医组（药物组）、冷凝型痛经模型组+壮药线艾灸组（艾灸组），每组12只大鼠。
载体组：动物用生理盐水 （0.9% 氯化钠） 处理。
模型组： 冷凝综合征痛经模型建模过程中，未进行干预，仅进行与艾灸组相同的约束和固定。
医药组： 从致敏^第 6 天起，每天灌胃给予溶于 0.9% 氯化钠溶液的布洛芬。每只大鼠给予 0.06 g/kg。
艾灸组： 从致敏^第 6 天开始，每日用壮药线进行艾灸治疗。该组每天上午 8 点接受 1 次治疗，连续 7 天。
所有动物均饲养在广西国际壮医医院实验动物科学中心（洁净级）。大鼠在塑料笼中喂养，4 只大鼠在一个笼子里。他们正常进食和饮水，保持昼夜节律交替，室内应该保持干燥。室温控制在 23 ± 1 °C，湿度为 60% ± 5%。

1. 痛经伴冷凝综合征大鼠模型的建立

1. 冷冻：在第 1-12 天，用腹膜内注射 0.3% 戊巴比妥 （30 mg/kg） 麻醉大鼠，然后将它们每天在冰上 20 分钟，连续 12 天。
2. 致敏： 第 1-12 天，皮下注射大鼠苯甲酸雌二醇，以增强子宫对引起疼痛物质的敏感性。在^第 1 天和^第 12 天，注射 0.8 毫克/动物;第 2^天至第 11 天，注射 0.4 毫克/动物。
3. 疼痛诱导：第 12^天， 注射苯甲酸雌二醇后 1 h，大鼠腹腔注射 2 U 催产素，引起疼痛。
   注：该模型是使用全身冷冻法结合苯甲酸雌二醇和催产素注射液¹⁰ 创建的。
4. 按照步骤 1.4.1-1.4.4 中的说明处理每个动物组。
   1. 对于载体组中的大鼠，不要执行步骤 1.1-1.3。单独用生理盐水（0.9% 氯化钠）治疗。
   2. 对于模型组中的大鼠，执行步骤 1.1-1.3。以类似于艾灸组的方式约束组中的动物，但没有任何药物/治疗干预。
   3. 对于药物组中的大鼠，执行步骤 1.1-1.3。从致敏的^第 6 天（步骤 1.2）开始，将布洛芬溶解在 0.9% 氯化钠溶液中，每天通过管饲法给药（0.06 g/kg）。
   4. 对于艾灸组中的大鼠，执行步骤 1.1-1.3。从致敏^第 6 天（步骤 1.2）开始，每天上午 8 点用壮药线（第 4 节）进行艾灸治疗，连续 7 天。

2. 设置壮药线程的艾灸模拟器

1. 长按 按钮 1 进入设置状态。短按 按钮 2 （加号） 或 按钮 3 （减号）， 将出现一个 132 代码。将按钮输入设置为每按一次输出 0.5 厘米。
2. 重复步骤 2.1 直到出现代码 130，设备可以在点火后 6 秒内自动点火。
3. 重复步骤 2.1，直到出现代码 131，仪器自动进行艾灸 2 次。
4. 旋转速度控制按钮将频率设置为 2 次/秒。
   注意： 按钮编号详见 补充图 1。

3. 壮药线的制备

1. 药液的制备
   1. 根据不同疾病的治疗选择药液配置。本实验中，使用乳香 10 克、檀香 10 克、木本香 10 克、桃仁 10 克、红花 10 克、当归尾 10 克、方峰 10 克、红牡丹 10 克、须木 10 克、干姜 10 克、姜黄 10 克。将这些成分浸泡在 1000 mL 的 75% 酒精中，并在 10 天后过滤以形成药液。
2. 浸泡药线：将苎麻线在上述药液中浸泡至少10天（图2），取出药线进行艾灸，将药线密封在瓶中备用。
3. 使用时每次取出一根长度约为 21 厘米的药用线（图 3）。

4. 壮药线灸的干预方法

1. 穴位选择
   注意：通过腹膜内注射 0.3% 戊巴比妥 （30 mg/kg） 麻醉大鼠。
   1. 使用小型动物剃须机清洁大鼠腹部的毛发。
   2. 根据线灸治疗痛经的经验，选择神阙、观元、中际、子宫穴等穴位^11、12、13 。用记号笔在大鼠的下腹部标记上述穴位。
      注意：穴位参见 图 4 。申阙（CV8，连接剑突和耻骨联合上缘的线上 2/3 和下 1/3 的交点）;关元（CV4，申阙穴下 25 mm）;中基（CV3，冠源穴下 8 mm）;左子宫穴位（左，EX-CA1，中济穴左侧开口 25 mm）;右侧子宫穴位（右，EX-CA1，中济穴右侧开口 25 毫米）。
2. 修复老鼠
   1. 使用高弹性橡皮筋（亚克力板尺寸 10 厘米× 15 厘米× 5 厘米）将大鼠固定在透明的亚克力板上，露出腹部。
   2. 将固定的大鼠放在壮药线灸模拟器的手术台上，调整定位环以粘附在大鼠的腹部，并左右调整大鼠的位置，使一个标记的穴位位于定位环的中心（图 5）。
3. 放置药物线
   1. 取出一根浸湿的药线，将其插入药线控制装置中。
   2. 旋转支撑框架垂直轴和水平轴上的螺丝旋钮。上下调整药物管路控制装置的外壳，使外壳底部与定位环底部的距离为 2 cm（图 6），并相应地调整点火支撑轴和定位杆轴。
   3. 单击进线按钮，将药丝露出距离外壳 0.5 厘米（将电线末端设置为每次按压退出 0.5 厘米）（图 7）。
4. 穴位艾灸
   1. 按下点火按钮，点火装置会自动点火。默认计时为 6 秒。之后，将进行两次自动艾灸，频率设置为 2 次/秒（图 8）
      注意：之前已经反复测试过，在温度为 23 ± 1 °C、湿度为 60% ± 5% 的无风环境中，6 秒后可能会形成珠火。
   2. 穴位艾灸后，移动透明亚克力框架以调整其位置，使下一个需要艾灸的穴位位于定位圈的中心。重复步骤 4.3.3 和 4.4.1。

5. 扭转划线操作

1. 给大鼠注射催产素 （2 U） 并将它们放入空笼中。
2. 观察每只大鼠在 20 分钟内的扭转反应。
   注意：除载体组外，每组选择 6 只大鼠。如果发生扭曲反应，则在大鼠中成功建立原发性痛经模型¹⁴。生理盐水组注射等剂量生理盐水。本研究使用了 Schmauss¹⁵提出的行为评分：对于正常的探索行为，0 分;躯干向一侧倾斜，腹部因收缩而向内凹陷，1 分;后肢伸展，后爪背屈，躯干伸展伴骨盆旋转，2 分;腹肌收缩、后肢伸展、3 分（图 9）潜伏期、扭转次数和扭转反应的扭转评分均在 20 分钟内记录。大鼠扭动的潜伏期是从注射催产素（引起疼痛）到大鼠首次出现扭动反应的时间（分钟）。
   扭转分数 = [0 级（次数）× 0 分 + 1 级（频率）× 1 分 + 2 级（频率）× 2 分 + 3 级（频率）× 3 分]。

6. 红外热成像

1. 通过腹膜内注射 0.3% 戊巴比妥 30 mg/kg 麻醉每组其余 6 只大鼠，暴露子宫投影区域。
2. 手术后，将大鼠置于红外热像仪镜头的视野中，并使用红外热像仪记录子宫投影区域的温度。
3. 测量每个穴位 3 次，取平均值作为该穴位的温度。
4. 使用热成像软件导出红外热图像（图 10）。
   注：建模第 12^{天 （} 即干预第^{7 天），} 每组其余 6 只大鼠进行红外热成像观察。患有冷凝综合征的原发性痛经大鼠子宫表面投影温度会降低。观察大鼠子宫的表面投影温度可以确定冷凝综合征的严重程度。温度越低，冷凝综合征越严重。

讨论

庄药线艾灸作为一种体验式手法治疗方法，分为点燃庄药线、等待形成珠火和艾灸与皮肤接触。壮药线灸操作过程中的关键因素是艾灸刺激量，这与强度、频率、热量密切相关，直接影响壮药线灸的生物效应。如何将艾灸的刺激量定量应用于壮药线艾灸的基础实验研究中，是一个亟待解决的问题，关系到实验结果的可靠性、稳定性和可重复性。因此，本文设计了一种保持恒定力、热量和频率的壮药线艾灸模拟器。为比较手法艾灸与壮药线灸模拟装置的差异，我们测试了模型组、手法艾灸组和壮药线艾灸模拟装置组的子宫表面投影温度。结果显示，手法和装置艾灸组的体表投射温度高于模型组 （p < 0.05）。手动艾灸组和设备艾灸组之间的体表投射温度无显著差异 （p > 0.05）。但是，从两组之间的标准差比较可以看出，设备组的标准差相对较小，表明稳定性强。手法艾灸组的标准差相对较大，表明手法艾灸操作波动很大（补充图 2）。同时，为了比较点燃过程中温度的突然升高是否对大鼠有影响，我们测量了装置组点火前和点火时的腹部皮肤（以申阙穴为测量点），结果表明，点火时刻对腹部皮肤温度没有影响（补充图 3）。

由于点燃药线时易受风干扰，建议在有遮蔽的环境中操作壮药线艾灸模拟器。药线点燃后，一般有明火、条火、珠火、径向火四种热条件。效果最好的是线呈“珠火”状时，避免使用明火艾灸¹⁶.点燃不同粗细的药线后，珠火形成的时间会有所不同。因此，在更换不同粗细的药线时，需要反复测试珠火的形成时间，在仪器上设置延迟时间，然后进行艾灸。同时对同一穴位进行艾灸的次数越多，刺激就越大。因此，必须根据实验需要选择合适的艾灸频率。

本实验构建了痛经大鼠冷凝综合征模型。通过扭转实验和子宫表面投影温度结果发现，壮药线灸能有效改善痛经伴冷凝证大鼠的疼痛反应，提高其子宫表面投射温度，提示庄药线灸积极改善痛经伴冷凝证形成的疼痛症状。临床研究表明，神阙、观元、中鸡、子宫穴位的经前治疗可有效治疗因凝血瘀滞引起的痛经。它们具有固基养气、补气低能、疏通局部气血的作用。以壮药烧线灸刺激穴位，结合暖热传导、穴位、药酒的联合作用，达到调气气血、活血化瘀、温散寒的作用，可明显改善痛经症状。

这个实验还是有一定的局限性的。由于技术限制，在有温度、湿度和无风的环境中，通过时间延迟来控制珠火的形成节点。下一步是进一步优化仪器，并使用图像识别功能更准确地控制发生胶条发射的节点。此外，由于人机交互面板无法显示详细参数，仪器无法直观地显示频率、温度等信息。未来，仪器的人机交互面板将得到丰富，使其操作更加智能。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estradiol Benzoate Injection	Shanghai Quanyu Biotechnology Animal Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A
Ice maker	Guoyi	GYXH-155
Infrared thermal imager	FLUKE	Ti32
Oxytocin Injection	Sichuan Jinke Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A
Ramie thread	Guangxi Nanning Shuqin Trading Co., Ltd.	N/A
Zhuang Pharmaceutical Line Moxibustion Simulator	In-house