吲哚菁绿血管造影表征新生血管性年龄相关性黄斑变性的血管形态

摘要

目前，荧光素血管造影 （FA） 是识别脉络膜新生血管形成 （CNV） 动物模型渗漏模式的首选方法。然而，FA不提供有关血管形态的信息。该协议概述了使用吲哚菁绿色血管造影（ICGA）来表征小鼠模型中激光诱导的CNV的不同病变类型。

摘要

年龄相关性黄斑变性（AMD）是老年人失明的主要原因，由于人口老龄化，其患病率正在迅速增加。脉络膜新生血管 （CNV） 或湿性 AMD 占所有 AMD 病例的 10%-20%，是导致 80%-90% 的 AMD 相关失明的原因。目前的抗VEGF疗法在约50%的患者中显示出次优反应。CNV 患者对抗 VEGF 治疗的耐药性通常与小动脉 CNV 相关，而应答者往往有毛细血管 CNV。虽然荧光素血管造影 （FA） 通常用于评估湿性 AMD 患者和动物模型的渗漏模式，但它不提供有关 CNV 血管形态的信息（小动脉 CNV 与毛细血管 CNV）。该协议介绍了使用吲哚菁绿色血管造影（ICGA）来表征激光诱导的CNV小鼠模型中的病变类型。该方法对于研究湿性AMD抗VEGF耐药的机制和治疗策略至关重要。建议将 ICGA 与 FA 合并，以在机制和治疗研究中全面评估 CNV 的渗漏和血管特征。

引言

年龄相关性黄斑变性 （AMD） 是一种普遍存在的疾病，会导致老年人严重视力丧失¹.仅在美国，AMD患者的数量预计将翻一番，到2050年将达到近2200万，而目前的1100万。在全球范围内，预计到 2040 年，AMD 病例数将达到惊人的 2.88 亿²。

脉络膜新生血管形成 （CNV），也称为“湿性”或新生血管性 AMD，由于中央视网膜下方形成异常血管，会对视力产生毁灭性影响。这会导致出血、视网膜渗出和严重的视力丧失。靶向细胞外 VEGF 的抗血管内皮生长因子 （VEGF） 疗法的引入彻底改变了 CNV 治疗。然而，尽管取得了这些进展，但高达 50% 的患者对这些疗法表现出次优反应，持续的疾病活动，例如积液和未解决或新发出血^{3、4、5、6、7、8、9、10}

研究方案

本研究中进行的动物实验获得了贝勒医学院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。所有程序均按照视觉和眼科研究协会 （ARVO） 关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明中概述的指南进行。本研究使用年轻（7-9 周）和老年（12-16 个月）C57BL/6J 雄性和雌性小鼠进行本研究。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 成像系统的准备

1. 在成像平台上放置加热垫（参见 材料表），以确保在成像过程中保持鼠标的体温。激活加热垫并将温度调节至 35 °C。
2. 取下防尘罩并打开激光扫描检眼镜。将 55° 镜头放在机器上。
3. 设置成像软件（见 材料表）并输入基本信息，包括基因型、性别、年龄等。当成像会话开始时，选择用于捕获ICGA图像的 IR （红外通道）。

2. ICGA和FA之前的动物准备

1. 称量小鼠以确定所需的麻醉量（氯胺酮/甲苯噻嗪 70-100/2.5-10 mg/kg，参见 材料表）。
   注意：优化剂量至关重要，因为不同小鼠品系的代谢特征不同。必须确定适当的剂量，以避免小鼠在完成成像之....

讨论

本研究证明了使用吲哚菁绿色血管造影 （ICGA） 在激光诱导 CNV 小鼠模型中鉴定小动脉和毛细血管脉络膜新生血管形成 （CNV） 的血管形态。吲哚菁绿 （ICG） 染料的血红蛋白结合和红外光特性使 CNV 形态的检测成为可能，这很难使用荧光素血管造影 （FA） 来实现，这是研究界目前采用的方法。

方案中的第一个关键步骤是确保将染料注射到腹膜腔中而不会穿透器官。在左下象?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
32-G Insulin Syringe	MHC Medical Products	NDC 08496-3015-01
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11008
Anti-α smooth muscle Actin antibody	Abcam	ab5694
Bovine Serum Albumin	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-2323
C57BL/6J mice (7-9 weeks)	The Jackson Laboratory	Strain #:000664
Fluorescein Sodium Salt	Sigma-Aldrich	MFCD00167039
Gaymar T Pump Heat Therapy System	Gaymar	TP-500	Water circulation heat pump for mouse recovery after imaging
GenTeal Gel	Genteal	NDC 58768-791-15	Clear lubricant eye gel
GS-IB4 Alexa-Flour 568 conjugate	Invitrogen	I21412
Heidelberg Eye Explorerer	Heidelberg Engineering, Germany	HEYEX2
Indocyanine Green	Pfaultz & Bauer	I01250
Ketamine	Vedco Inc.	NDC 50989-996-06
Paraformaldehyde	Acros Organics	416785000
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%)	Sandoz	NDC 61314-016-01
Spectralis Multi-Modality Imaging System Heidelberg Engineering, Germany SPECTRALIS HRA+OCT Tropicamide ophthalmic solution (1%) Bausch & Lomb NDC 24208-585-64 for dilation of pupils GenTeal Gel Genteal NDC 58768-791-15 clear lubricant eye gel Ketamine Vedco Inc NDC 50989-996-06 Xylazine Lloyd Laboratories NADA 139-236 Acepromazine Vedco Inc NDC 50989-160-11 32-G Needle Steriject PRE-32013 1-ml syringe BD 309659 Indocyanine Green Pfaltz & Bauer I01250	Heidelberg Engineering, Germany	SPECTRALIS HRA+OCT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-1L
Tropicamide ophthalmic solution (1%)	Bausch & Lomb	NDC 24208-585-64	For dilation of pupils
Xylazine	Lloyd Laboratories	NADA 139-236