从诱导多能干细胞中产生悬浮液中的肾脏类器官

摘要

该方案提供了一种使用悬浮培养条件从诱导多能干细胞（iPSC）生产肾脏类器官的全面有效的方法。本研究的主要重点在于确定初始细胞密度和 WNT 激动剂浓度，从而使对肾脏类器官研究感兴趣的研究人员受益。

摘要

肾脏类器官可以通过多种方法从诱导多能干细胞 （iPSC） 中产生。这些类器官在疾病建模、药物筛选和潜在的治疗应用方面具有巨大的前景。本文介绍了从 iPSC 创建肾脏类器官的分步过程，从后原始条纹 （PS） 到中间中胚层 （IM）。该方法依赖于 APEL 2 培养基，这是一种确定的、不含动物成分的培养基。它补充高浓度的 WNT 激动剂 （CHIR99021），持续 4 天，然后补充成纤维细胞生长因子 9 （FGF9）/肝素和低浓度的 CHIR99021，持续 3 天。在此过程中，重点是在 iPSC 开始时选择最佳细胞密度和CHIR99021浓度，因为这些因素对于成功生成肾脏类器官至关重要。该协议的一个重要方面是在低贴壁板中悬浮培养，允许 IM 逐渐发育成肾单位结构，包括肾小球、近端肾小管和远端肾小管结构，所有这些都以视觉上可理解的形式呈现。总体而言，该详细方案提供了一种有效且特定的技术，可从不同的iPSC中生产肾脏类器官，从而确保成功和一致的结果。

引言

肾脏在维持生理稳态方面起着关键作用，具体取决于其功能单位。排泄废物的肾单位可以调节体液的成分。由遗传突变或其他高危因素引起的慢性肾脏病 （CKD） 最终会发展为终末期肾病 （ESKD）^1,2。ESKD显然是由于肾单位的再生能力有限。因此，需要肾脏替代疗法。人类 iPSC 的定向分化能够在体外生成患者特异性 3D 肾脏类器官，可用于研究肾脏发育、模拟患者特定疾病和进行肾毒性药物筛选 ^3,4。

在胚胎发育过程中，肾脏起源于中间中胚层 （IM），这与原始条纹 （PS） 不同。经典的 WNT 信号通路可能在 FGF （FGF9， FGF20） 和 BMP （通过 JNK 的 Bmp7 信号转^导）的协调参与下诱导 IM 的额外分化5,6,7。它们产生肾祖细胞 （NPC） 的两个重要细胞群：输尿管芽 （UB） 和肾间充质 （MM），分别形成集合管和肾单位 ^8,9

研究方案

用于本研究的 iPSC 是从商业来源获得的。将细胞用 mTeSR 培养基维持在市售的基底膜基质包被板上（参见 材料表）。 表1 包含研究中使用的所有培养基组合物。

1. 接种 iPSC 以分化和诱导后原始条纹 （PS）

1. 用 2 mL DPBS 在膜基质包被的 6 孔板上洗涤 iPSC。使用移液器吸出DPBS。
2. 加入1mL市售的细胞分离溶液（参见 材料表）以分离iPSCs，并在37°C下孵育5分钟。
3. 向 iPSC 中加入 1 mL mTeSR，并确保细胞已从塑料表面抬起。
4. 在室温（RT）下以400× g 离心细胞3分钟。重悬细胞沉淀并使用血细胞计数器计数细胞数。
5. 将一系列细胞密度接种到涂有膜基质的 24 孔或 6 孔板上，并用补充有 10 μM Rho 激酶抑制剂 （Y-27632） 的 mTeSR 培养（参见 材料表）。将它们在37°C CO₂ 培养箱中培养过夜。
   注：为了诱导 PS，CHIR99021的最佳浓度和合适的细胞密度因不同的 iPSC 细胞系而异。接种密度范围（例如，每平方厘米0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.4 * 10 3^{个单细胞....}

讨论

已经描述了从 iPSC 生成肾脏类器官的详细方案，包括对基础培养基、初始细胞密度和CHIR99021浓度的微小修改。在各种实验中，发现成功产生肾脏类器官的关键因素是中间中胚层 （IM） 的初始分化和第 7 天的细胞状态。此外，不同的iPSC细胞系表现出细胞增殖和分化潜力的变化，导致不同的最佳细胞密度和CHIR99021浓度5,13,14。因此.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom	NEST	Cat #701003
Accutase	STEMCELL Technologies	Cat #o7920
Antibodies
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich	Cat #100-51-6
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	Cat #120-51-4
Biological Safety Cabinet	Haier	Cat #HR40  A2
Biotin anti-human LTL (1:300)	Vector Laboratories	Cat #B-1325
Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female)	N/A	N/A
Carbon dioxide level shaker	HAMANY	Cat #C0-06UC6
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
CHIR99021 (Wnt pathway activator)	STEMCELL Technologies	Cat #72054
Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate	Corning	Cat #3516
Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Corning	Cat #3471
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	Cat #07930
DAPI stain Solution	Coolaber	Cat #SL7102
Dextran, Alexa Fluor 647	Thermo SCIENTIFIC	Cat #D22914
DMEM/F-12 HEPES-free	Servicebio	Cat #G4610
Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	Cat #ab150179
Donkey serum stoste	Meilunbio	Cat #MB4516-1
D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red)	Solarbio Life Science	Cat #D1040
Dry Bath Incubator	Shanghai Jingxin	Cat #JX-10
Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032210
Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032220
Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032310
Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032320
Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032620
Experimental models: Cell Lines
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator	Thermo SCIENTIFIC	Cat #370
Geltre LDEV-Free	Gibco	Cat #A1413202
Glass Bottom Culture Dishes	NEST	Cat #801002
Goat anti-human CUBN (1:300)	Santa Cruz Biotechnology	Cat #sc-20607
Heparin Solution (Cell culture supplement)	STEMCELL Technologies	Cat #07980
Human Recombinant FGF-9	STEMCELL Technologies	Cat #78161
Inverted Microscope	OLYMPUS	Cat #CKX53
Laser Scanning Confocal Microscope	OLYMPUS	Cat #FV3000
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	Cat #M7027
Micro Centrifuge	HENGNUO	Cat #2-4B
Mouse anti-human CD31 (1:300)	BD Biosciences	Cat #555444
Mouse anti-human ECAD (1:300)	BD Biosciences	Cat #610182
Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)	Abcam	Cat #ab30394
Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)	Thermo SCIENTIFIC	Cat #39795
Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88)	Sigma-Aldrich	Cat #81381
mTeSR1 5X Supplement	STEMCELL Technologies	Cat #85852
mTeSR1 Basal Medium	STEMCELL Technologies	Cat #85851
Nunc CryoTube Vials	Thermo SCIENTIFIC	Cat #377267
Others
Rabbit anti-human GATA3 (1:300)	Cell Signaling Technology	Cat #5852S
Rabbit anti-human LRP2 (1:300)	Sapphire Bioscience	Cat #NBP2-39033
Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)	Abcam	Cat #ab224491
Rabbit anti-human WT1 (1:300)	Abcam	Cat #ab89901
Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)	Abcam	Cat #ab32570
Recombinant Human Serum Albumin (rHSA)	YEASEN	Cat #20901ES03
Sheep anti-human NPHS1 (1:300)	R&D Systems	Cat #AF4269
STEMdiff APEL 2 Medium	STEMCELL Technologies	Cat #05275
Streptavidin Cy3 (1:400)	Gene Tex	Cat #GTX85902
Versene (1X)	Gibco	Cat #15040066
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	Cat #72304