重组RCAS（A）逆转录病毒显微注射到胚胎鸡晶状体中

摘要

该协议论文描述了RCAS（A）逆转录病毒的胚胎鸡晶状体显微注射的方法，作为研究晶状体发育过程中蛋白质原 位 功能和表达的工具。

摘要

胚胎鸡（Gallus domesticus）是一种成熟的动物模型，用于研究晶状体发育和生理学，因为它与人类晶状体高度相似。RCAS（A）是一种具有复制能力的鸡逆转录病毒，可感染分裂细胞，是研究晶状体发育过程中野生型和突变蛋白原 位 表达和功能的有力工具，在早期发育阶段通过显微注射到晶状体囊泡的空腔中，将其作用限制在周围增殖的晶状体细胞中。与转基因模型和 离体 培养等其他方法相比，使用具有复制能力的禽逆转录病毒提供了一种高效、快速和可定制的系统来表达雏鸡胚胎中的外源蛋白。具体来说，靶向基因转移可以局限于增殖的晶状体纤维细胞，而不需要组织特异性启动子。在本文中，我们将简要概述重组逆转录病毒RCAS（A）制备所需的步骤，提供显微注射程序的详细、全面的概述，并提供该技术的样本结果。

引言

该协议的目的是描述RCAS（A）（具有复制能力的禽肉瘤/白血病逆转录病毒A）的胚胎鸡晶状体显微注射的方法。在胚胎鸡晶状体中有效的逆转录病毒递送已被证明是 体内研究晶 状体蛋白在正常晶状体生理学、病理状况和发育中的分子机制和结构功能的有前途的工具。此外，该实验模型还可用于人类先天性白内障等疾病的治疗靶点识别和药物筛选。总而言之，该协议旨在为开发用于研究晶状体蛋白的可定制平台制定必要的步骤。

胚胎雏鸡（Gallus domesticus）由于其晶状体结构和功能与人类晶状体相似，是研究晶状体发育和生理学的成熟动物模型1,2,3,4。使用具有复制能力的 RCAS（A） 禽逆转录病毒被认为是在雏鸡胚胎中表达外源蛋白的高效、快速和可定制的系统。值得注意的是，它具有独特的能力，可以将靶基因转移限制在增殖的晶状体纤维细胞中，而不需要组织特异性启动子，使用独特的胚胎发育时间框架，其中空晶状体腔的存在允许原位 RCAS（A） 显微注射到受限位点，以便在增殖晶状体纤维细胞内表达外源性蛋白质^5，

研究方案

本研究是按照《动物福利法》和《动物福利实施条例》的原则，根据《实验动物护理和使用指南》的原则进行的。所有动物程序均由德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心机构动物护理和使用委员会批准。有关协议的概述，请参阅 图 1;有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参阅 材料表 。

图1：实验大纲。1. 方案的第一步是确定特定的靶蛋白，鉴定相关基因序列，并生成 DNA 片段。 2 . 通过初始克隆到接头载体中，将基因序列克隆到逆转录病毒载体中， 3. 然后是病毒载体。 4. 使用包装细胞制备高滴度病毒颗粒，以收获和浓缩。 5. 最后一步，也是该协议的重点，是将RCAS（A）病毒颗粒的鸡晶状体显微注射到晶状体腔中。

讨论

该实验模型提供了在完整晶状体中表达目标蛋白质的机会，从而研究了这些蛋白质在晶状体结构和功能中的功能相关性。胚胎雏鸡显微注射模型部分基于Fekete等人的工作。^al.6，并由Jiang等人进一步发展。^al.8 并已被用作将病毒质粒和试剂（如激动剂、小干扰 RNA （siRNA） 和肽）插入雏鸡晶状体的手段 1,9,10,11,12,13。^<.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Filter	Corning	431118	For removing cellular debris from media
35 mm x 10 mm Culture Dish	FisherScientific	50-202-030	For using during microinjection
Centrifuge	Fisherbrand	13-100-676	Spinning down solution
Constructs	GENEWIZ	-	For generation of constructs
Dissecting microscope	AmScope	SM-4TZ-144A	Visualization of lens for microinjection
DNA PCR primers	Integrated DNA Technologies	-	Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were  obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector	Drummond Scientific	3-000-204	Microinjection Pipet
Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator	AmScope	LED-50WY	Lighting for visualization
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen		For cell culture
Egg Holder	-	-	Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height
Egg Incubator	GQF Manufacturing Company Inc.	1502	For incubation of fertilized eggs
Fast Green	Fisher scientific	F99-10	For visualization of viral stock injection
Fertilized white leghorn chicken eggs	Texas A&M University	N/A	Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone Laboratories		For cell culture
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-095-003	For anti-FLAG  1:500
Forceps	FisherScientific	22-327379	For moving things around and isolation
Glass capillaries	Sutter Instruments	B100-75-10	Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)
Lipofectamine	Invitrogen	L3000001	For transfection
Manual vertical micropipette puller	Sutter Instruments	P-30	To obtain glass micropipette of the correct size
Microcentrifuge Tubes	FisherScientific	02-682-004	Dissolving solution
Microscope	Keyence	BZ-X710	For imaging staining
Parafilm	FisherScientific	03-448-254	Placing solution
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen		For cell culture
Pico-Injector	Harvard Apparatus	PLI-100	For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time
rabbit anti-chick AQP0	Self generated	-	Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
rabbit anti-FLAG antibody	Rockland Immunichemicals	600-401-383	For staining FLAG
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-295-003	For anti-AQP0  1:500
Sponge clamping pad	Sutter Instruments	BX10	For storage of glass micropipette