人诱导多能干细胞分化为间充质基质细胞的两种代表性方法比较

摘要

该协议描述并比较了将hiPSC分化为间充质基质细胞（MSCs）的两种代表性方法。单层法的特点是成本更低，操作更简单，更容易成骨分化。胚状体（EBs）方法的特点是时间消耗更短。

摘要

间充质基质细胞（MSCs）是成体多能干细胞，在再生医学中得到了广泛的应用。由于体细胞组织来源的 MSC 受到有限捐赠、质量差异和生物安全性的限制，过去 10 年中，从人类诱导多能干细胞 （hiPSC） 中产生 MSC 的努力大幅增加。过去和最近将hiPSCs分化为MSCs的努力都集中在两种培养方法上：（1）胚状体（EBs）的形成和（2）单层培养的使用。该协议描述了从hiPSCs中提取MSC的这两种代表性方法。每种方法都有其优点和缺点，包括时间、成本、细胞增殖能力、MSC标志物的表达及其 体外分化能力。该协议表明，这两种方法都可以从hiPSCs中获得成熟且功能性的MSC。单层法的特点是成本更低、操作更简单、更容易成骨分化，而EB法的特点是时间消耗更短。

引言

间充质基质细胞 （MSC） 是中胚层来源的成体多能干细胞¹。间充质干细胞存在于几乎所有结缔组织中².自 1970 年代首次发现 MSC 并于 1987 年由 Friedenstein 等人成功从骨髓中分离出来 ^3,4,5 以来，各种人类体细胞（包括胎儿和成人）组织已被用于分离 MSC，例如骨骼、软骨、肌腱、肌肉、脂肪组织和造血支持基质 ^1,2,6,7.间充质干细胞表现出高增殖能力和可塑性，可分化为许多体细胞谱系，并可迁移到受伤和发炎的组织 ^2,8,9。这些特性使间充质干细胞成为再生医学的潜在候选者¹⁰.然而，体细胞组织来源的 MSC （st-MSCs） 受到有限的捐赠....

研究方案

1. hiPSCs维持

1. hiPSC的解冻
   1. 从液氮中取出细胞，在37°C水浴中快速解冻细胞。将解冻细胞转移到用 3 mL iPSC 维持培养基制备的 15 mL 管中（材料表）。轻轻混合培养基。
   2. 以300 ×g 离心5分钟。除去上清液，轻轻将细胞重悬于含有 10 μM Y-27632 的 1 mL iPSC 维持培养基中（上下移液细胞 2-3 次）。
   3. 将细胞悬浮液转移到涂有生长因子降低 （GFR） -细胞外基质凝胶 （1：100） 和 2 mL iPSC 维持培养基的 6 孔组织培养板中，预先添加 10 μM Y-27632（约 4 x 10⁴ 个细胞/cm²）。
   4. 将细胞在37°C，5%CO₂ 下培养5-6天（80%-90%汇合度），每天更换iPSC维持培养基。
2. hiPSC的通过
   1. 从 6 孔板中取出 iPSC 维持培养基。用DPBS洗涤hiPSC一次。
   2. 加入 700-800 μL 0.48 mM EDTA 溶液，在室温 （RT） 下孵育 1 分钟，然后取出消化溶液。继续在37°C温度下孵育3-5分钟。
   3. 当细胞消化成片状（不要将细胞消化成单细胞）时，加入 1 mL 含有 10 μM Y-....

讨论

在该协议中，检查了将hiPSCs分化为MSCs的两种代表性方法20,21,22,23,24,25,26,27,28,30。两种方法都能够从hiPSCs中衍生MSCs。通过细胞形态（

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin red staining kit	Beyotime Biotechnology	C0148S
Anti-human-CD105 (PE)	Biolegend	323206
Anti-human-CD34 (FITC)	Biolegend	343503
Anti-human-CD45 (APC)	Biolegend	304011
Anti-human-CD73( APC)	Biolegend	344006
Anti-human-CD90 (FITC)	Biolegend	328108
Ascorbic acid	Solarbio	A8100
BMP-6	Novoprotein	C012
Carbon dioxide level shaker	Crystal	CO-06UC6
Compensation Beads	BioLegend	424601
CryoStor CS10	STEMCELL Technology	07959
Dexamethasone	Beyotime Biotechnology	ST1254
DMEM/F12  medium	Servicebio	G4610
Fetal bovine serum	HAKATA	HS-FBS-500
FGF2	Stemcell	78003.1
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2500-100G
GlutaMAX	Gibco	35050061
human IgG1 isotype control APC	BioLegend	403505
human IgG1 isotype control FITC	BioLegend	403507
human IgG1 isotype control PE	BioLegend	403503
Human TGF-β1	Stemcell	78067
Human TruStain FcX	BioLegend	422301
IBMX	Beyotime Biotechnology	ST1398
Indomethacin	Solarbio	SI9020
Insulin	Beyotime Biotechnology	P3376
iPSC maintenance medium	STEMCELL Technology	85850
ITS Media Supplement	Beyotime Biotechnology	C0341-10mL
Matrigel, growth factor reduced	BD Corning	354230
Oli Red O staining kit	Beyotime Biotechnology	C0158S
Proline	Solarbio	P0011
Sodium pyruvate	ThermoFisher	11360-070
TGFβ3	Novoprotein	CJ44
Toluidine blue staining kit	Solarbio	G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)	Gibco	12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Costar	3471
Versene	Gibco	15040-66
Y-27632	Stemcell	72304
α-MEM	Hyclone	SH30265
β-glycerophosphate	Solarbio	G8100