人外周血单核细胞的冷冻保存与生物能量评价

摘要

分离的外周血单核细胞可用于分析免疫功能和疾病、代谢疾病或线粒体功能。在这项工作中，我们描述了一种从全血制备PBMC和随后冷冻保存的标准化方法。冷冻保存使这个时间和地点独立。

摘要

真核细胞的生理功能主要依赖于线粒体提供的能量。线粒体功能障碍与代谢疾病和衰老有关。氧化磷酸化起着决定性的作用，因为它对于维持能量稳态至关重要。PBMC 已被确定为测量线粒体功能的微创样本，并已被证明可以反映疾病状况。然而，线粒体生物能量功能的测量可能受到人类样本中几个因素的限制。限制是采集的样本量、采样时间（通常分布在几天内）和位置。对收集的样品进行冷冻保存可以确保样品的一致收集和测量。应注意确保测得的参数在冷冻保存的细胞和新制备的细胞之间具有可比性。在这里，我们描述了从人类血液样本中分离和冷冻保存PBMC的方法，以分析这些细胞中线粒体的生物能量功能。与新鲜收获的细胞相比，根据此处描述的方案冷冻保存的PBMC在细胞数量和活力，三磷酸腺苷水平和测量的呼吸链活性方面仅显示出微小的差异。所述制剂只需要 8-24 mL 人血，因此可以在临床研究期间多中心收集样本并在现场测定其生物能量学。

引言

人外周血单核细胞 （PBMC） 用于许多科学领域的各种应用，包括研究免疫学和生物能量问题，例如与衰老过程或退行性疾病相关的问题 ^1,2。PBMC 的组成是异质的，由淋巴细胞（B 细胞、T 细胞和 NK 细胞）、单核细胞和树突状细胞组成。这些细胞有时会在受试者中表现出巨大的个体差异和变异，因此需要处理这些细胞的标准化程序。分离物的活力和纯度等重要参数是其处理的基本要求，并且还受到环境因素的影响，例如收集时间、褪黑激素水平、受试者是否禁食等 ^3,4。

基于对PBMCs生物能量学的研究，我们在此描述了一种适用于其他方法的PBMCs的分离、冷冻保存和培养方法。虽然肌肉活检被认为是线粒体能量代谢的金标准⁵，但血细胞检查是一种快速、微创的手术。除此之外，越来越多的研究表明，衰老和阿尔茨海默病（AD）中线粒体功能的变化不仅发生在大脑中，还发生在外周6,7,8,9,10。^....

研究方案

本手稿中描述的所有采血、分离和分析方案均已由德国吉森大学机构审查委员会审查和批准。获得了患者同意将他们的样本纳入研究。分离和细胞培养的所有步骤均在生物安全柜下进行。

1. 静脉穿刺

1. 准备采血所需的所有设备，包括消毒喷雾、无菌拭子、带 80 毫米管和多功能适配器的采血插管、止血带/血压袖带、Monovette 9 mL 肝素锂。
   注意：EDTA作为抗凝剂也是有效的。
2. 从最合适的手臂静脉采集血液，通常是肘正中静脉或头静脉。
3. 使用止血带/血压袖带，轻压约 80 毫米/汞柱。
4. 用含有酒精的消毒喷雾对手套和穿刺部位进行消毒。让消毒的穿刺部位风干。
5. 静脉由于压力袖带的压力而突出。将针头（套管直径（外侧）21G / 0.8 mm，长度 19 mm）与静脉成 15°-20° 角，试图避免创伤并尽量减少探查。
6. 使用适当的系统采集血液，4 个装有 9 mL 血液的试管（一个实验者正确分离超过 7-8 个试管是有问题的）。
7. 采血后，将采集管置于黑暗中5分钟，以确保均匀抗凝。

2. PBMC隔离

1. 准备所有需要的解决方案，如下所述。
2. 将Dulbecco的平衡盐溶液（DPBS;浓度1x）....

讨论

该协议提供了一种以适合生物能量分析的方式从人血液中分离和冷冻保存外周血单核细胞（PBMC）的方法。所描述的方法提供了温和和大量分离PBMC的可能性，具有高活力和足够的细胞用于生物能量测量。它的缺点是，即使中断最小，也会发生长时间的分离，但随后的冷冻保存允许对生物能量学进行与时间无关的测量。使用这种方法，可以在以后的时间点收集和测量样品。它还适用于在多中心试验?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0)	Self-prepared	-
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer	Self-prepared	-
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1)	Self-prepared	-
1.01 mM DTBB	Self-prepared	-
10 % Triton X-100	Self-prepared	-
10 mM Oxalacetat	Self-prepared	-
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly	Sarstedt	156353_v
37% HCl	Carl Roth GmbH & Co. KG	-
70% Ethanol (EtOH)	Self-prepared	-
Acetyl-CoA	Pancreac Applichem	A3753
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Alcohol wipes			(70% isopropyl alcohol)
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674
Aqua (bidest.)	With MilliQ Academic (self-made)	-
Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
ATP-Standard	Sigma-Aldrich	6016949
Biocoll Seperating Solution	Biochrom	6115
Biological safty cabinet MSC Advantage	Thermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell counter TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R	Thermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counter	Bio-Rad	1450016
Cryotube Cryo.S	Grainer Bio-One	126263-2DG
Digitonin	Sigma-Aldrich	37008
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Merck	102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTips	Gilson	F164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x)	Gibco (Thermo Scientific)	15217168
Ethanol (EtOH 100%)	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9065.3
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665
Frezer (-80°C)	Thermo Fisher Scientific Inc.
Glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
Holder/adapter
Incubator Midi 40 CO2	Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringe	Hamilton
Malate	Sigma-Aldrich	M-1000
MIR05	Self-prepared	-
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc.	10110051
Multireader CLARIOstar	BMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plus	Thermo Fisher Scientific Inc.
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876
Oxalacetate	Sigma-Aldrich	-
Oxygraph-2k	Orobororus Instruments
Penicillin-Streptomycin	PAA	15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL	VWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640)	Gibco (Thermo Scientific)	11530586
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Saccharose	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9286.2
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD)	Sigma-Aldrich	T3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methane	Sigma-Aldrich	108382
Triton X-100	Sigma-Aldrich	108643
Trypanblau	Biochrom	T6146
Vacuum pump	Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96	Perkin Elmer	6005181
Water bath WNB22	Memmert GmbH & Co. KG