本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 代表性结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

信号通路的光遗传学操作可以成为研究信号转导在发育、再生、稳态和疾病中如何解码的有力策略。该协议为在早期斑马鱼胚胎中使用基于光 - 氧 - 电压传感域的节点和骨形态发生蛋白（BMP）信号激活剂提供了实用指南。

摘要

信号通路协调基本的生物过程，包括发育、再生、体内平衡和疾病。需要实验性地操纵信号的方法，以了解在这些广泛的环境中如何解释信号。分子光遗传学工具可以提供可逆的、可调的信号通路活性操作，并具有高度的时空控制，并已 在体外、 体外和 体内应用。这些工具将光响应性蛋白质结构域（例如蓝光同源二聚化光氧电压传感 （LOV） 结构域）与信号效应器偶联，以赋予对信号转导的光依赖性实验控制。该协议为在光学可及的早期斑马鱼胚胎中使用基于LOV的骨形态发生蛋白（BMP）和节点信号激活剂bOpto-BMP和bOpto-Nodal提供了实用指南。它描述了两个对照实验：用于确定适当实验条件的快速表型测定，以及用于直接评估信号转导的免疫荧光测定。总之，这些对照实验可以帮助建立在早期斑马鱼胚胎中使用光遗传学工具的管道。这些策略为研究信号转导在发育、健康和生理学中的作用提供了一个强大的平台。

引言

信号通路使细胞能够对其环境做出反应，并在组织和生物体范围内协调活动。对胚胎发育至关重要的信号包括 TGF-β 超家族成员骨形态发生蛋白 （BMP） 和节点 1,2,3。在胚胎发生过程中，由这些信号和其他信号调节的通路通过控制基因表达和其他过程来塑造身体计划，以确保不同的组织和器官正确发育和连接。当信号传导或对信号传导的反应受到干扰时，可能会发生病理学，包括出生缺陷和癌症 4,5,6,7。尽管对信令进行了严格的研究，但关于如何在各种上下文中解码电平和动态仍有待发现 8,9,10,11，特别是在开发过程中 12,13,14,15,16,17,18,19。

为了了解信号是如何解码的，一个理想的实验是操纵信号水平、时间和/或动态——具有高度的空间和时间控制——并评估结果。例如，提出了精确的空间信号梯度来模式化发育中的组织20,21。改变信号梯度空间分布将有助于检验这一假设22。此外，信号动力学在产生不同细胞反应中的重要性正变得越来越清晰：相同的信号通路可以指示细胞根据信号转导频率分化或增殖，例如9,23。可以轻松操纵信号动力学的实验范式对于探索动力学与细胞命运决定之间的关系很有价值 8,12,13,14,15。

从历史上看，多种方法已被用于在发育环境中操纵信号传导，从而导致了基本发现 1,2,3。可以使用通路功能丧失突变体、异位抑制剂表达或拮抗剂药物来阻断信号转导。激活信号转导的方法包括激动剂药物、重组配体、配体或组成型活性受体的异位表达以及通路抑制剂功能丧失突变体。这些方法的范围是连续的实验控制。例如，突变体和异位表达可能落在连续体的大锤侧：通过这些方法，通路活性的戏剧性、全身性变化可能导致早期死亡并排除后期研究，或者随着时间的推移可能导致难以解开的多效性效应。此外，一次独立操作一个信令特征（例如电平或持续时间）通常具有挑战性。在连续体的另一端，一些方法提供更精确的实验控制，例如将样品暴露于具有时间和有时空间控制的药物或重组蛋白的微流体装置 18,24,25，或遗传方法，包括热休克诱导和组织特异性启动子，可以提供类似的益处16,26,27.然而，这些方法可能难以执行，可能是不可逆的，可能具有相对较慢的动力学或较差的分辨率，并且可能在某些模型系统中不可用。

分子光遗传学方法是该工具包的有力补充。这些方法使用对不同光波长做出反应的蛋白质来操纵生物过程，包括信号传导 8,12,13,14,15，并且已经开发了几十年，用于从细胞培养到整个动物的各种系统 12,13,28.与历史方法相比，分子光遗传学通常可以对生物过程提供更高程度的时空控制：光遗传学系统中的控制器是光，光波长、强度、持续时间和曝光频率的控制相对简单。使用共聚焦和双光子显微镜等复杂的系统，可以在亚细胞范围内进行空间控制 29,30,31。光遗传学操纵信号转导的工具已经开发并应用于多个系统，包括 Johnson 等人 22、Čapek 等人 32、Krishnamurthy 等人 33 和 Huang 等人 34 中描述的工具。例如，利用光遗传学提供的空间控制，该策略最近被用于修改果蝇胚胎中的信号梯度，证明苍蝇胚胎发生对该梯度的变化具有惊人的鲁棒性22。光遗传学信号激活剂的可逆性和快速开/关动力学也使它们成为研究信号动力学解码的有吸引力的工具 8,12,13,14,15,34,35,36。

早期的斑马鱼胚胎是一个非常适合光遗传学研究的 体内 系统，因为它是外部受精的、透明的、显微镜友好的，并且在遗传上易于处理。光照更容易传递给在母亲之外发育的胚胎，光可以穿透并进入它们的非透明组织，活斑马鱼胚胎对成像的耐受性很好（除了透明之外），现有的遗传方法为敲低和过表达实验提供了直接的机会，此外还开发了有用的转基因技术37。

最近，开发了光遗传学工具来激活蓝光暴露的斑马鱼胚胎中的 BMP38 和 Nodal39 信号传导（图 1）。我们将这些工具称为 bOpto-BMP 和 bOpto-Nodal（b 代表蓝光激活，Opto 代表光遗传学）。bOpto-BMP/Nodal基于类似的通路激活机制。BMP 或 Nodal 配体与其各自的受体丝氨酸-苏氨酸激酶的结合驱动受体激酶结构域相互作用，导致信号转导效应子的磷酸化（BMP 为 Smad1/5/9，节点为 Smad2/3）。然后，磷酸化信号转导效应子转移到细胞核并调节靶基因表达3（图1A，D）。这些受体激酶相互作用可以通过将受体激酶偶联到光反应性二聚化蛋白来产生光反应性：在光照下，这些嵌合蛋白应该二聚化，导致受体激酶结构域相互作用并激活信号传导（图1B，C，E，F）。重要的是，与内源性受体相比，bOpto-BMP/Nodal 不含细胞外配体结合结构域，确保了不依赖配体的活性（图 1C，F）。这种光遗传学激活策略首先通过受体酪氨酸激酶40,41,42 实现，然后应用于受体丝氨酸-苏氨酸激酶。

bOpto-BMP/Nodal 使用来自藻类 Vaucheria fridiga AUREO1 蛋白 （VfLOV） 的蓝光响应 （~450 nm） 同源二聚化光氧电压传感 （LOV） 结构域43,44。这些构建体由一个靶向膜的肉豆蔻酰化基序组成，然后是BMP或节点受体激酶结构域，融合到LOV结构域（图1B，E）。蓝光照射应引起LOV同源二聚化，导致受体激酶结构域相互作用，导致各自的Smad磷酸化和通路激活（图1C，F）。对于 bOpto-BMP，发现与来自 Acvr1l（也称为 Alk8）和 BMPR1aa（也称为 Alk3）的 I 型受体激酶结构域以及来自 BMPR2a 的 II 型受体激酶结构域的构建体组合可最佳激活信号转导38（Addgene #207614、#207615 和 #207616）。对于 bOpto-Nodal，使用来自 Acvr1ba 的 I 型受体激酶结构域和来自 Acvr2ba 的 II 型受体激酶结构域的构建体的组合39。

bOpto-BMP/Nodal 已通过在单细胞阶段注射 mRNA 引入早期斑马鱼胚胎，并用于研究信号转导持续时间在节点解释中的作用39，确定斑马鱼失去响应节点的能力 45，并检查 BMP 靶基因如何响应不同的 BMP 信号水平38.这些工具很可能在未来的各种调查中继续发挥作用。然而，光遗传学信号激活剂的优势也是它们的弱点：必须小心处理光敏样品，以避免无意中的异位信号转导活动。暴露在室内光线或阳光下可以激活 bOpto-BMP/Nodal。

该协议为在早期斑马鱼胚胎中使用基于mRNA编码的基于LOV的BMP和Nodal激活剂提供了实用建议。它首先详细介绍了一种构建灯箱以控制均匀光照和温度的策略（图 2，补充文件 1、补充文件 2、补充文件 3、补充文件 4、补充文件 5、补充文件 6、补充文件 7、补充文件 8）。然后，它描述了两个关键的对照实验，这些实验确定光遗传学信号激活剂的行为是否符合预期，即仅在暴露于光时激活通路活性（图3）。第一种对照测定涉及在受精后一天检查光照和未照射胚胎的表型（图3A）。mRNA注射的光暴露胚胎，但不是未暴露的胚胎，应表型BMP或节点过表达（图4A，B;特别是BMP表型在这个时间点可以清楚地区分46）。该测定法可快速读取活性。在第二种对照测定中，为了确定表型是否由过量的 BMP 或 Nodal 信号转导特异性引起并直接观察信号水平的变化，使用免疫荧光染色来检测磷酸化信号转导效应子（分别为 pSmad1/5/9 或 pSmad2/3）在胚泡晚期/原肠胚早期前后光照 20 分钟后，当信号活性已得到充分描述时12， 16,17,47,48,49,50（图3B和图4C）。（请注意，尽管已经证明了 bOpto-BMP38 和 bOpto-Nodal39 的空间局部激活，但该协议仅描述了均匀的光照和信号激活策略。建议在将bOpto-BMP / Nodal应用于特定研究问题之前执行这些控制实验，以确定理想的局部实验条件。

研究方案

斑马鱼研究方案由美国国立卫生研究院 （National Institutes of Health） 的 NICHD 动物护理和使用委员会 （ASP 21-008） 审查和批准。所有斑马鱼研究均按照《实验动物护理和使用指南》进行。

1. 搭建灯箱

  1. 为了控制光照和温度，构建一个使用发光二极管 （LED） 微孔板照明器作为光源的灯箱（图 2A， 材料表，补充文件 1，补充文件2）。这种可定制的照明器可对多个波长进行动态、可编程的控制。
    注意：构建灯箱的可能策略有很多种，替代方法可能更合适（参见例如，Gerhardt 等人 51、Bugaj 等人 52、Kumar 和 Khammash53 等，参见 https://www.optobase.org/materials/）。
  2. 在灯箱中包括以下功能：温度控制（28°C是斑马鱼胚胎的理想选择），排除不需要的光（例如，室内光和阳光），均匀地传递覆盖目标区域的蓝光（例如，6孔板），以及控制光强度和曝光动态。
    注意：bOpto-BMP/Nodal 被蓝光激活，但一些光遗传学工具对其他波长有反应。为光遗传学工具使用适当的波长。
  3. 在培养箱顶部钻一个比 LED 输出透镜略宽的孔（图 2B）。
    1. 确保培养箱顶部没有会被钻孔破坏的电气元件（材料表）。这可以通过联系孵化器制造商并直接询问来确定。
    2. 如果孵化器的顶板上有一个孔，请使用阶梯钻将孔尺寸增加到 1.25 英寸。否则，请使用带心轴的 1.25 英寸孔锯。
    3. 如果有内部面板阻挡光源，请钻出适当的孔尺寸以确保光锥不被阻挡（图 2A）。面板通常由薄金属板制成，因此请使用低速和金属钻头以防止损坏（建议使用钴钻头）。
  4. 构建一个 LED 支架以将 LED 微孔板照明器固定到培养箱的顶部（图 2C，补充文件 3、补充文件 4、补充文件 5、补充文件 6、补充文件 7、补充文件 8）。
    1. 使用 M3 螺钉将四个 M3 立方体支架安装到垂直支架件上。
    2. 将两个侧支架连接到垂直支架的立方体支架的左侧和右侧。将另一个立方体支架安装到侧支架上的剩余孔上。
    3. 使用 M6 螺钉将垂直支架件安装到 LED 微孔板照明器组件（材料表）上。将 LED 透镜垫圈放在 LED 系统透镜上。
    4. 将组装好的部件安装到培养箱面板支架上，然后安装到垂直和侧面支架上的 M3 支架上。将培养箱垫圈放在培养箱顶部的钻孔上。
    5. 将培养箱面板支架放在培养箱垫圈的顶部，确保垫圈和面板开口与培养箱的孔同心。使用 8 号螺钉将面板安装到培养箱顶部。确保此密封件是不透光的。
  5. 将 6 孔板放在培养箱的顶部架子上。确定光束是否均匀地覆盖板（图2A）。使用一张纸来可视化光线覆盖。
  6. 如果整个板没有被光束覆盖，请通过向下移动搁板来增加 LED 和板之间的距离。对于此处描述的系统，LED 和搁板之间的 ~14 英寸就足够了。
  7. 使用测光表确定辐照度水平和空间均匀性（材料表）。
  8. 为避免无意中的阳光和室内光线照射，请使用挡风雨条确保培养箱门不透光（图 2A）。
  9. 斑马鱼胚胎在28°C下发育旺盛54.使用存储卡温度计确保灯箱保持 28 °C。

2. 生成注射用mRNA

注：pCS2+ 是 bOpto-BMP 构建体38 和 bOpto-Nodal 构建体39 的矢量主链。该载体对氨苄西林具有耐药性。bOpto-BMP由三种构建体组成（图1B）：BMPR1aa-LOV（Addgene#207614）：与LOV融合的I型BMPR1aa受体（也称为Alk3）的假定激酶结构域;Acvr1l-LOV （Addgene # 207615）：与 LOV 融合的 I 型 Acvr1l 受体（也称为 Alk8）的推定激酶结构域;和 BMPR2a-LOV （Addgene # 207616）：II 型 BMPR2a 受体的推定激酶结构域和以下 C 端结构域与 LOV 融合。bOpto-Nodal由两种构建体组成（图1E）：Acvr1ba-LOV：与LOV融合的I型Acvr1ba受体（也称为Acvr1b）的推定激酶结构域;Acvr2ba-LOV：II 型 Acvr2ba 受体（也称为 Acvr2b）与 LOV 融合的推定激酶结构域。

  1. 为了线性化质粒，在37°C下使用NotI限制性内切酶消化2-5μg质粒DNA，持续1-3小时（材料表）。
    注：也可以使用质粒作为PCR模板生成线性化DNA。
  2. 使用标准柱式纯化试剂盒（材料表）纯化DNA。
  3. 使用 体外 SP6 转录试剂盒（如 mMessage mMachine 试剂盒）从线性化模板（材料表）转录 RNA。根据制造商的建议设置两个反应，以确保更高的产量。
  4. 使用标准柱式RNA纯化试剂盒（材料表）纯化RNA。也可以通过沉淀进行净化。

3. 注射mRNA

  1. 至少在注射前 1 天，制作注射皿和琼脂糖包被的 6 孔板。
    1. 在斑马鱼胚胎培养基中制备 200 mL 1% 琼脂糖，然后微波加热，直到琼脂糖完全溶解。任何标准的斑马鱼胚胎培养基都应该是可以接受的;但是，从胚胎培养基中排除亚甲蓝，因为它会影响其他应用中的下游成像。
    2. 小心地将熔融的琼脂糖倒入100mm×15mm塑料培养皿中。将盘子装满一半。
    3. 用胚胎培养基冲洗注射皿模具，然后轻轻放在熔融的琼脂糖上，确保模具和琼脂糖之间没有气泡。使用胶带在模具背面制作标签，以便于放置和取回。
    4. 模具应漂浮在熔融的琼脂糖中。如果模具下沉，小心地从熔融的琼脂糖中取出并重复步骤3.1.3。
    5. 琼脂糖凝固后，用标签轻轻去除霉菌。这可以通过将培养皿置于4°C来加速。
    6. 如果使用去皮胚胎进行免疫荧光实验，请制作琼脂糖包被的 6 孔板。
    7. 使用一次性 10 mL 塑料移液管转移足够的熔融琼脂糖以覆盖 6 孔板每个孔的底部。
    8. 将注射培养皿和6孔板储存在4°C。 它们可以立即使用或储存，直到琼脂糖变干或污染（通常为2-3周）。
    9. 如果使用去皮胚胎进行免疫荧光实验，请准备火焰玻璃移液器吸头。
    10. 将玻璃移液管的末端插入本生燃烧器火焰中并不断旋转，直到边缘光滑。去绒毛的胚胎必须舒适地穿过移液管的末端。不要让开口收缩到胚胎直径以下。
    11. 购买或拔出显微注射针（材料表）。建议在注射当天准备额外的针头，以防需要更换。
  2. 在注射前一天，根据研究所的标准操作程序（SOP）设置斑马鱼饲养员。将男性和女性分开。
    1. 打开灯箱温度调节器以保持 28 °C。 为确保灯箱温度保持在 28 °C，请使用存储卡温度计（材料表）监测温度。
    2. 准备mRNA注射混合物。注入每种结构的等摩尔量。有必要根据经验确定注射量。
    3. bOpto-BMP 转录本大小如下：
      Acvr1l-LOV = 2007 个核苷酸 （nt）
      BMPR1aa-LOV = 1983 nt
      BMPR2a-LOV = 3409 吨
    4. 要注射等摩尔量，注射的 Acvr1l 构建体比 BMPR1aa 多 1.01 倍;注入的 BMPR2a 构建体比 BMPR1aa 多 1.72 倍。
    5. bOpto-Nodal 转录本大小如下：
      Acvr1ba-LOV 和 Acvr2ba-LOV 都是 1962 nt。
    6. 要注射等摩尔量，请注射相同量的每种构建体。
    7. 制备等摩尔进样混合物，将靶向一种通路的所有mRNA组合到一种进样混合物中。如果需要，包括酚红注射示踪剂。对于 图 4 所示的数据，使用每个 bOpto-Nodal 构建体（Acvr1ba-LOV 和 Acvr2ba-LOV）的 15 pg，对于 bOpto-BMP 使用 7.8 pg Acvr1l-LOV 和 BMPR1aa-LOV，使用 13.4 pg BMPR2a-LOV。
    8. 将进样混合物储存在-20°C。 一旦确定了注射混合物的最佳浓度，制成5-10μL等分试样并储存在-20°C或-80°C。
  3. 注射日
    1. 如果进行表型分析（图3A），则根据实验室的SOP将绒毛膜直接注射到单细胞阶段的细胞中心。绒毛膜保护胚胎免受环境压力的影响，并保持裂解的胚胎。这有助于在评分过程中准确定量裂解的胚胎（图4A，B）。
    2. 如果进行免疫荧光测定（图3B），胚胎最终需要去皮细胞成像（图4C）。因此，在单细胞阶段直接注射到去皮胚胎的细胞中心（参见Rogers等人55 的去皮治疗方案）。或者，胚胎可以在固定后手动去皮，但这比用假蛋白酶去皮更麻烦。
    3. 使用火焰玻璃移液器处理去皮胚胎（步骤3.1.10）。注意不要将去皮的胚胎暴露在空气或塑料中，这会导致胚胎裂解。轻柔地处理去皮的胚胎。
    4. 准备一个额外的未注射胚胎作为替代物来评估阶段进展（参见步骤4.3.5）。确保代理胚胎来自同一组实验胚胎，以便所有胚胎同时从同一父母那里受精。这对于与阶段相关的免疫荧光测定很有用，但对于表型测定则没有必要。
    5. 使用以下条件进行表型分析和免疫荧光测定：1）非注射，未暴露，2）未注射，暴露于光线，3）注射，未暴露，4）注射，暴露于光线。每种情况至少选择30个胚胎。为了获得最佳的胚胎健康，不要在6孔板中每孔孵育超过30个胚胎。
    6. 注射后，将胚胎转移到标记的培养皿或琼脂糖包被的6孔板（用于去皮胚胎）并在28°C下孵育。 胚胎还不对光敏感。在受精后 1.5 小时 （hpf） 后将注射的胚胎视为对光敏感的胚胎。

4.光照实验

注意：暴露于辐照度为 45 W/m2 的 ~450 nm 光可稳健地激活 bOpto-BMP/Nodal，而不会产生明显的光毒性（有关测光表的信息，请参阅 材料表）。光基因激活的信号水平可以通过改变辐照度值38来调整。然而，光毒性需要在更高的辐照度下进行评估。

  1. 对时间敏感的步骤。在 4 至 16 细胞阶段，大约 1.5 hpf，去除未受精和不健康的胚胎。如有必要，重新分配以确保每个孔中的胚胎数量相同（不超过30个）。
    注意：在 4 到 16 细胞阶段执行此步骤很重要，因为当注射的 mRNA 被翻译成蛋白质时，胚胎会变得对光敏感。我们没有观察到胚胎在1.5 hpf之前对光有明显敏感的证据。为了尽量减少在1.5 hpf后评估胚胎时无意中的光活化，请使用红光，或用红色凝胶滤纸覆盖光源 - 包括显微镜载物台 - 阻挡LOV二聚化蓝色波长（材料表）。
    1. 始终如一地评估胚胎，以确保条件和实验之间的公正分布。
  2. 对于表型测定，使用以下从1.5 hpf开始的1天光暴露方案（图3A）。
    1. 将未暴露的控制板包裹在铝箔中。该板应包括未注射和注射的胚胎。确保盘子完全覆盖，并注意不要将撕裂引入箔纸。将该板放在28°C灯箱的下层架子上（图2A）。
    2. 将暴露的板放在28°C灯箱的顶部架子上（图2A）。确保盖子在培养皿上，以避免胚胎培养基蒸发。打开蓝光（45 W/m2 的辐照度强烈地激活信号）。
    3. 关闭灯箱门，避免无意中暴露在室内光线下。如果需要，在关门前在灯箱内放置一个存储卡温度计。在受精后 1 天进行表型评分之前不要打开门（dpf;参见步骤 5.1）。
  3. 对于免疫荧光测定，将胚胎暴露在蓝光下20分钟，从约40%epiboly56 （~6hpf）开始，并在光照后立即与未暴露的对照一起固定（图3B）。在 40% 表观下暴露 20 分钟可重复地激活信号传导。
    1. 大约 1.5 hpf，分别用铝箔包裹暴露和未暴露的盘子。确保盘子完全覆盖，并注意不要让眼泪进入箔纸。将代理盘打开包装。将包装好的盘子和未包装的代理盘子放在28°C灯箱中（图2A）。不要打开 LED。
    2. 如果测试超过一个 mRNA 量，对于未暴露的情况，将注射不同量的胚胎分类到单个琼脂糖包被的 6 孔板中，这将有助于最大限度地减少后续固定期间的无意光照。
    3. 关闭灯箱门，避免无意中暴露在室内光线下。
    4. 在 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中将甲醛原液稀释至 4%，并将 1 mL 分装到预先标记的 2 mL 圆底微量离心管中，每种条件一管。储存在4°C。
    5. 大约 5 hpf，取出含有未注射胚胎的代理皿，并使用解剖镜评估发育阶段。代理胚胎的阶段应反映包裹培养皿中光敏胚胎的阶段。
    6. 将包裹好的盘子也取出，使所有盘子都经历相同的温度。重复直到代理胚胎达到 40% 表皮 （~6 hpf）。胚胎发生进程对温度敏感54;因此，培养皿在培养箱外的时间越长，胚胎达到 40% 表皮所需的时间就越长。
    7. 一旦代理胚胎达到40%的表观，打开暴露的培养皿并将其放在灯箱的顶部架子上（图2A）。将未暴露的盘子包裹起来，放在下层架子上。立即打开蓝灯，关上门，并将计时器设置为 20 分钟（45 W/m2 的辐照度强烈地激活信号）。
    8. 为准备注视，请尽可能多地消除室内光线（关闭百叶窗、关闭顶灯、关闭屏幕等）。确保含甲醛的试管贴有适当的标签。固定前，从4°C取出含甲醛的管子，放在灯箱旁边。
    9. 对时间和光敏感的步骤。准备好在 20 分钟的光照结束时快速移动。20 分钟后，打开灯箱门并取出未曝光的盘子。
    10. 使用火焰玻璃移液器吸头快速但轻柔地将光敏胚胎转移到准备好的4%甲醛相应管中。
    11. 尽量减少光敏胚胎的移植时间（<45秒），以避免无意中暴露在光下。确保移液器中没有气泡。暴露在空气中会破坏去皮的胚胎。
    12. 要将胚胎喷射到甲醛中，请将玻璃移液器吸头浸入甲醛中，让胚胎沉入液体中。通过将胚胎保持在尖端的末端，尽量减少转移到甲醛中的胚胎培养基的量。
    13. 胚胎移植后，将移液器放回同一孔中，上下移液以去除任何卡住的胚胎。这可以防止多种情况下的胚胎意外地进入一个管子。
    14. 立即对未暴露的未注射胚胎重复步骤4.3.11-4.3.13，然后对暴露的胚胎（注射和非注射）重复。
    15. 将固定胚胎在4°C下储存过夜。

5. 实验评价

  1. 表型评分和影像学检查
    1. 在 1 dpf 下，理想情况下在 24-32 hpf 之间，从灯箱中取出胚胎以使用解剖镜评估表型并创建评分标准。这是实验终点;无意中的光活化不再是一个问题。
    2. 在胚胎中轻松评分。使用移液器或探针移动胚胎，以便从多个角度观察。
      1. 经历过量BMP信号传导的胚胎将以不同程度的严重程度进行腹侧化，如Kishimoto等人所详细描述的那样。199746 （图4A，左图）。经历过多淋巴结信号转导的胚胎将具有一系列与过多的中胚层相关的发育缺陷（图4A，右图）1,3,47,57,58,59,60。它们通常会裂解 1 dpf。
    3. 在所有条件下对每个胚胎进行评分（图4B）。获取每个孔中所有胚胎的概览图像。如果需要，在甲基纤维素中对单个代表性胚胎进行去皮化和成像（图4A）。
  2. 免疫荧光染色和成像
    1. 将胚胎在4°C的4%甲醛中孵育过夜后，除去甲醛并用1x磷酸盐缓冲盐水和吐温20（PBST）洗涤3-5x。除去PBST，加入100%甲醇。
    2. 关闭试管并轻轻倒置它们以混合残留的PBST和甲醇。用甲醇洗涤2x，并在-20°C下储存至少2小时长达数年。
    3. 对于pSmad1/5/9（BMP）免疫荧光方案，参见Rogers等人38。对于 pSmad2/3（节点）免疫荧光方案，参见 van Boxtel 等人 17 和 Rogers 等人 47。
    4. 使用能够进行光学切片的显微镜（例如，共聚焦或光片显微镜）对免疫染色的胚胎进行成像。避免饱和，并在用相同抗体染色的所有样品之间保持相同的成像条件。
    5. 完成免疫荧光染色后 5 天内的图像，因为荧光可能会随着时间的推移而消退。

代表性结果

这里描述的两个对照实验的目的是确定 bOpto-BMP/Nodal 是否像预期的那样，在没有光的情况下激活它们各自的通路以响应蓝光照射而不影响信号传导。在将 bOpto-BMP/Nodal 应用于您感兴趣的研究问题之前，使用这些控件在您的实验室中建立适当的实验工作流程。

表型测定只需 2 天即可完成，并提供信号转导活性和光毒性的有用指示（图 3A）。注射的、暴露于蓝光的胚胎应表型复制过量的BMP信号（腹侧化46;图4A，左图）或淋巴结信号（与中胚层外1,3,47,57,58,59,60相关的发育缺陷（图4A，右图））。如果注射，暴露在光下的胚胎是无异常细胞的，测试mRNA的质量并考虑注射更多，并仔细检查曝光策略以确保持续暴露在强光下（~450 nm光，辐照度为45 W /m 2应强烈激活信号传导）。相比之下，注射的、未暴露的胚胎应该看起来与未注射的兄弟姐妹相同。如果注射，未暴露的胚胎表现出表型，减少注射的mRNA量并重新评估实验设置，以确保未暴露的胚胎免受光照。图4B中显示的数据显示了具有适当mRNA量和暴露条件的典型表型实验的结果：在注射的光照胚胎中，强烈的信号活性是显而易见的，只有一小部分注射的未暴露胚胎表现出表型。

表型分析还为评估光毒性提供了机会。如果光毒性可以忽略不计，则非注射、光照的胚胎应为野生型，类似于未注射、未暴露的胚胎。如果未注射、暴露于光的胚胎有缺陷，但未注射、未暴露的胚胎没有缺陷，请考虑降低光照度。45 W/m2 的辐照度可稳健地激活信号转导，而不会产生明显的光毒性。 图4B 中显示的数据显示，未注射、光照和未注射、未照射的胚胎之间没有差异，表明光毒性可以忽略不计。

尽管与表型测定（2 天）相比，免疫荧光测定需要更多的时间和精力（~1 周），但免疫荧光染色可直接读取信号通路活性，并可能揭示可能无法反映的细微信号转导变化。免疫荧光对于评估对 bOpto-Nodal 的反应尤为重要，因为过量的 Nodal 信号通常会导致胚胎裂解 1 dpf（这可能有很多原因），这与过量 BMP 信号转导的特异性腹侧化表型特征形成鲜明对比46 （图 4A）。与未注射的、暴露于光的胚胎相比，注射的、暴露于蓝光的胚胎应表现出均匀增加的 Smad1/5/9 或 Smad2/3 磷酸化。如果水平没有增加，或只是微弱增加，请测试mRNA的质量并考虑注射更多，并仔细检查光照策略。暴露于辐照度为 45 W/m2 的蓝光 20 分钟，表观度约为 40%，应强烈激活信号传导。如果 pSmad 染色不均匀，请尝试将 mRNA 注射到细胞中心（而不是卵黄），这可能会导致 mRNA 分布更均匀。

注射的、未暴露的胚胎应具有与未注射胚胎相当的 pSmad 水平。有趣的是，我们观察到 bOpto-Nodeal 的 Smad 磷酸化比 bOpto-BMP 更泄漏。如果注射的未暴露胚胎的pSmad水平升高，请减少注射的mRNA量。此外，重新评估实验设置，以确保 1） 未暴露的胚胎不会无意中暴露在光线下，以及 2） 固定期间的光暴露是最小的。在固定步骤中，从灯箱中取出和浸入甲醛之间不超过 45 秒至关重要。此外，在此步骤中，通过关闭百叶窗、关闭白光源、使用红光或用防蓝光凝胶滤纸覆盖白光源（材料表），尽量减少暴露在室内光线和阳光下。

图4C中的数据显示了在适当的mRNA量和光照条件下进行的典型免疫荧光染色实验的结果：pSmad水平在未注射和未暴露的胚胎中相似，而注射的光照胚胎表现出更高水平的Smad磷酸化。

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图 1：bOpto-BMP 和 -Nodal 信号激活策略。 （A）内源性BMP信号通路被BMP配体结合激活，导致I/II型受体复合物的形成，Smad1/5/9的磷酸化和BMP靶基因的表达。I 型受体 BMPR1aa 和 Acvr1l 也分别称为 Alk3 和 Alk8。BMPR2a 是一种 II 型受体。（B） bOpto-BMP 构建体38.来自 BMPR1aa 和 Acvr1l 的推定激酶结构域与 LOV 融合;BMPR2a-LOV 融合包含推定的激酶结构域和受体 C 末端结构域 （CTD）。所有融合都是膜靶向的，具有肉豆蔻酰化基序 （Myr）。结构域由甘氨酸-丝氨酸 （GS） 接头分隔。构建体在 CTD 处用 HA 表位标记。发现这种三种结构的组合可以最佳地激活BMP信号传导。（C） bOpto-BMP介导的BMP信号激活。当暴露于蓝光时，LOV结构域二聚化，这被认为会触发复合物的形成和信号激活。（D） 内源性 Nodal 信号通路被 Nodal 配体结合激活，导致 I/II 型受体复合物的形成、Smad2/3 的磷酸化和 Nodal 靶基因的表达。I 型受体 Acvr1ba 和 II 型受体 Acvr2ba 也分别称为 Acvr1b 和 Acvr2b。（E） b光节点结构39.来自 Acvr1ba 和 Acvr2ba 的推定激酶结构域与 LOV 融合。所有融合都是膜靶向的，具有肉豆蔻酰化基序 （Myr）。域由 GS 链接器分隔。构建体在 CTD 处用 HA 表位标记。（F） bOpto-Nodal介导的Nodal信号激活。当暴露于蓝光时，LOV结构域二聚化，这被认为会触发复合物的形成和信号激活。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 2：用于光遗传学实验的温控灯箱 。 （A） 使用定制的 LED 支架将 LED 微孔板照明器安装在培养箱的顶部。将第一个架子上6孔板中的斑马鱼胚胎通过钻入培养箱顶部的孔暴露在光线下。下层架子在铝箔包裹的 6 孔板中容纳第二组未暴露的对照胚胎。培养箱门内衬有挡风雨条，以防止无意中暴露在室内光线或阳光下。（B） 使用阶梯钻在培养箱上打孔的程序细节。这里使用的孵化器模型有一个内部面板，需要钻第二个更大的孔（材料表）。（C） 为三波长照明系统设计的定制 LED 灯座的详细信息。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 3：bOpto-BMP/Nodal 实验工作流程。 表型测定和 pSmad 免疫荧光染色以测试 bOpto-BMP/Nodal 的活性。在单细胞阶段向胚胎注射mRNA，并在受精后（hpf）不迟于1.5小时转移到灯箱中。（A） 表型测定。注射的胚胎和未注射的兄弟姐妹在黑暗中饲养或暴露在均匀的蓝光下，从1.5 hpf开始，直到受精后1天（dpf）。光遗传学信号活性可以通过对胚胎进行与过量通路活性一致的表型评分来评估。（B）pSmad免疫荧光染色。将注射的胚胎和未注射的兄弟姐妹在黑暗中饲养，直到40%的表壳（~6 hpf）。然后将一半注射和一半未注射的胚胎暴露在均匀的蓝光下20分钟。暴露后，将所有胚胎固定并进行免疫荧光染色以进行pSmad。pSmad1/5/9 或 pSmad2/3 水平升高分别反映了 BMP 或 Nodal 信号转导的光遗传学激活。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图4：评估斑马鱼胚胎中的光激活信号转导反应。 斑马鱼胚胎在单细胞阶段注射编码 bOpto-BMP/Nodal 的 mRNA。（A）胚胎要么在黑暗中饲养，要么从受精后1.5小时（hpf）开始暴露在均匀的蓝光下。在受精后 1 天 （dpf） 对表型进行评分。图中显示了代表性表型。过量的BMP信号转导导致腹侧化（左图），而过量的淋巴结信号转导导致与中胚层外的发育缺陷相关的发育缺陷（右图）。比例尺 = 500 μm。 （B） 表型定量。注射的胚胎和未注射的兄弟姐妹在黑暗中饲养，从1.5 hpf（黑色鳞茎）开始。一半注射的胚胎和一半的未注射胚胎暴露在均匀的蓝光下（蓝色灯泡）。（C） 注射的胚胎和未注射的兄弟姐妹在黑暗中饲养，从 1.5 hpf（黑色鳞茎）开始。在40%表壳（~6 hpf）下，一半的注射和一半的未注射胚胎暴露于均匀的蓝光（蓝色灯泡）。20分钟后，将所有胚胎固定并进行磷酸化Smad1/5/9或Smad2/3的免疫荧光染色。较高的 pSmad 强度分别表明 BMP/Nodal 信号转导增加。比例尺 = 200 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

补充文件1：灯箱全装配。 3D PDF 文件，显示整个灯箱组件的 3D 视图。 请点击这里下载此文件。

补充文件2：灯箱分解图。 显示分解灯箱组件的 3D 视图的 3D PDF 文件。 请点击这里下载此文件。

补充文件3：大轻质垫片。 CAD 绘图文件 （.DWG 格式）使用激光切割机制造 LED 灯座的大光垫圈。 请点击这里下载此文件。

补充文件4：小轻垫片。 CAD 绘图文件 （.DWG 格式）使用激光切割机制造 LED 灯座的小光垫圈。 请点击这里下载此文件。

补充文件5：亚克力平台底座。 CAD 绘图文件 （.DWG 格式）使用激光切割机制造 LED 灯座亚克力平台底座。 请点击这里下载此文件。

补充文件6：亚克力平台垂直。 CAD 绘图文件 （.DWG格式）使用激光切割机垂直制造LED灯座亚克力平台。 请点击这里下载此文件。

补充文件 7：亚克力支撑左侧。 CAD 绘图文件 （.DWG 格式）使用激光切割机制造 LED 支架亚克力左支架。 请点击这里下载此文件。

补充文件8：亚克力支撑权。 CAD 绘图文件 （.DWG 格式）使用激光切割机制造 LED 支架亚克力右支架。 请点击这里下载此文件。

讨论

注射 mRNA 是目前将 bOpto-BMP/Nodal 递送至斑马鱼胚胎的策略。这种方法有几个缺点。首先，mRNA的适量因实验室而异。使用的量应足以在光照下强烈地激活信号转导，但不会无意中暗激活。最好测试多个量以找到最佳 mRNA 水平，一旦确定，创建预混液的等分试样以可重复地引入相同量的 mRNA。其次，注射的mRNA分布不均匀可能导致信号转导激活不均匀。注射到细胞中心（而不是卵黄）被认为可以促进均匀的mRNA分布。最后，由于注射的mRNA会随着时间的推移而降解，这种方法可能不适合在较老的胚胎中进行实验。将来，这些问题可以通过转基因斑马鱼品系来解决，这些斑马鱼品系普遍表达带有母体或药物诱导启动子的bOpto-BMP/Nodal。尽管在这种情况下，与潜在的光敏成年斑马鱼一起工作可能是一个挑战，但斑马鱼 61,62 和果蝇 22,34,35,63 已经成功开发了携带光遗传学工具的转基因。

避免无意的光活化是光遗传学工具的普遍挑战。为简单起见，将年龄超过 1.5 hpf 的注射胚胎视为光敏胚胎。通常可以通过简单地用铝箔包裹盘子或盘子来避免无意中的光照。然而，对于需要目视观察年龄大于1.5 hpf的活胚胎的实验，可以使用红色光源或用廉价的凝胶滤纸覆盖白色光源，以阻挡LOV二聚化波长（材料表）。

这里描述的灯箱专为需要精确控制光辐照度水平、动力学和波长的特定应用而设计（图 2）。该灯箱的其他优点包括均匀的光照、可忽略不计的意外样品加热、为多个 6 孔板提供充足的空间以及长寿命、光谱特征良好的光源。然而，根据研究应用的不同，不同的光照策略可能更可取。许多实验室已经开发了更简单、更具成本效益的均匀光照系统，占地面积更小，包括用 LED 灯条衬里培养箱、将 LED 面板悬挂在样品上或将 LED 纳入培养皿盖中32、38、39、40、64、65、66.重要的是，该协议中使用的灯箱不允许用户独立调节单个孔（与Bugaj等人52相反）或提供对光照的空间控制。分别在 SPIM 或共聚焦系统中使用激光的 bOpto-BMP38 和 bOpto-Nodal39 证明了空间局部光遗传学激活，并且还通过各种模型系统中的许多其他光遗传学策略实现了（在 Rogers 和 Müller12 中讨论）。一些方法甚至实现了亚细胞空间分辨率29,30,31。尽管空间局部光照射系统的实现超出了该协议的范围，但理论上可以使用专用设备（例如数字微镜设备或掩蔽方法）进行bOpto-BMP / Nodal的空间激活实验。鼓励读者在采用光照策略之前，先浏览有关用于光遗传学实验的 DIY 灯箱的大量文献（例如，参见 Gerhardt 等人 51、Bugaj 等人 52、Kumar 和 Khammash53 等，见 https://www.optobase.org/materials/）。

与突变体、异位基因表达、重组蛋白和药物等历史方法相比，分子光遗传学策略通常对生物过程提供更高程度的时空控制。对光遗传学方法的好处感兴趣的读者可以探索斑马鱼和其他生物中可用的其他已发表工具。这些包括操纵其他信号通路 32,65,67,68、调节基因表达 61、64、66、69、70、71、改变蛋白质定位 31,72 和激活细胞凋亡62 的工具.这些工具和许多其他工具都可以方便地在 OptoBase 上编目，OptoBase 是分子光遗传学方法的精选网络资源28。对于那些受到启发创造新型光遗传学工具的人，该资源还对光响应蛋白进行了有用的描述，这些蛋白已被广泛用于各种策略，包括对绿色、红色和近红外波长做出反应的光响应蛋白。我们很高兴科学界能够充分发挥分子光遗传学方法的潜力。

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

该协议的资金由 NICHD 校内计划向 KWR （ZIA HD009002-01） 提供。我们感谢 Jeff Farrell 和他的实验室提供的启发性反馈，感谢 Will Anderson 的出色技术支持，感谢 Leanne Iannucci 对协议进行压力测试和测量辐照度，感谢 NIH 共享斑马鱼设施为保持斑马鱼健康所做的辛勤工作。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Building a light box & Light exposure protocol
#8 x 1" Hex Self-drilling ScrewMcMaster-Carr99663A2221.4.5
Digital Optical Power and Energy MeterThorLabsPM100D1.7
4
Incubator (142 liters)Boekel Scientific1394001.3.1
Incubator Panel Mount (1/4" thick cast black acrylic)Custom part / Piedmont PlasticsIncubator_panel1.4.4
Large HSS Spiral Groove Step Drill BitCO-ZSDB0001TA1.3.2
LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32" thick black siliconeMcMaster-Carr5812T121.4.3
1.4.4
LED microplate illuminatorPrizmatixNA1.1
1.4.3
M3 10mm Cube StandoffNewark Eletronics005.60.5331.4.1
M3 x 10mm 316SS Flat Head ScrewMcMaster-Carr91801A1561.4.1
M6 x 10mm 316SS Flat Head ScrewMcMaster-Carr91801A3051.4.3
Memory card thermometerFisherbrand15-081-1111.9
3.2.1
Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW)ThorLabsS170C1.7
4
Red gel filter paper #E106Rosco / B&H Foto & Electronics110084014805-E1064.2.1
Side Brackets (1/4" thick cast black acrylic)Custom part / Piedmont PlasticsSide_bracket1.4.2
Vertical Bracket (1/4" thick cast black acrylic)Custom part / Piedmont PlasticsVertical_bracket1.4.1
Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2" wd 1/4" tkMcMaster-Carr8694K121.8
Generating mRNA
EZNA MicroElute Cycle Pure KitOmegaD6293-022.4
GeneJET Miniprep Kit (250 rxns)Thermo ScientificK05032.2
Microsample incubator (Hybex)SciGene1057-30-02
Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex)SciGene1057-34-02
Nanodrop One SpectrophotometerThermo ScientificND-ONE-W2.4
NotI-HF restriction enzymeNew England Biolabs (NEB)R3189L2.1
pCS2-Opto-Alk3Addgene2076142
pCS2-Opto-Alk8Addgene2076152
pCS2-Opto-BMPR2aAddgene2076162
RNeasy Mini Kit (250 rxns)Qiagen741062.3
Injecting mRNA
Agarose (UltraPure)Invitrogen / Thermo Fisher165005003.1.1
250 ml glass beakersFisherbrandFB1002503.3.2
6-well dishes (case of 50)Falcon08 772 1B3.1.6
B-8A ball jointNarishigeB-8A3.3
Back pressure unit (microinjection rig component)Applied Scientific Instrumentation (ASI)BPU3.3
Foot switch (microinjection rig component)Applied Scientific Instrumentation (ASI)FWS3.3
GJ-1 magnetic standNarishigeGJ-13.3
Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament)World Precision Instruments1B100F-43.1.11
Glass petri dish bottoms (for dechorionating)Pyrex08-748A3.3.2
Glass pipettes (5 3/4" with wide tip)Kimble-Chase63A53WT3.1.9
Injection dish moldsAdaptive Science Toolstu13.1.3
IP iron plateNarishigeIP3.3
M-152 micromanipulatorNarishigeM-1523.3
Micro pipette holder kit (microinjection rig component)Applied Scientific Instrumentation (ASI)MIMPH-MPIP-Kit3.3
MicrometersMeiji Techno AmericaMA2853.3
MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component)Applied Scientific Instrumentation (ASI)MPPI-33.3
Needle pullerWorld Precision InstrumentsPUL-10003.1.11
Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500)Falcon08-757-100D3.1.2
Pipettor (10 ml, green)Bel-ArtF37898-00003.3
PronaseRoche114596430013.3.2
Squeeze bottles (500 ml)Nalgene / Thermo Scientific2402-05003.3

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