研究胰腺β细胞线粒体自噬通量的互补方法

摘要

该协议概述了对胰腺β细胞中线粒体自噬进行定量分析的两种方法：第一种是细胞渗透性线粒体特异性染料的组合，第二种是遗传编码的线粒体自噬报告基因。这两种技术是互补的，可以根据特定需求进行部署，从而在定量解决线粒体质量控制问题时具有灵活性和精确性。

摘要

线粒体自噬是维持最佳线粒体功能所必需的质量控制机制。功能失调的β细胞线粒体自噬导致胰岛素释放不足。线粒体自噬的高级定量评估通常需要使用遗传报告基因。mt-Keima 小鼠模型表达了一种线粒体靶向 pH 敏感的双激发比率探针，用于通过流式细胞术定量线粒体自噬，已在β细胞中进行了优化。酸性与中性 mt-Keima 波长发射的比率可用于稳健地量化线粒体自噬。然而，在处理复杂的遗传小鼠模型或难以转染的细胞（如原代人类胰岛）时，使用遗传线粒体自噬报告基因可能具有挑战性。该协议描述了一种基于互补染料的新型方法，用于使用MtPhagy量化原代胰岛中的β细胞线粒体自噬。MtPhagy 是一种对 pH 敏感的细胞渗透性染料，当线粒体处于低 pH 值环境中时，例如线粒体自噬期间的溶酶体，它会积聚在线粒体中并增加其荧光强度。通过将 MtPhagy 染料与 Fluozin-3-AM（一种选择β细胞的 Zn²⁺ 指示剂）和四甲基罗丹明乙酯 （TMRE） 相结合来评估线粒体膜电位，可以通过流式细胞术特异性定量β细胞中的线粒体自噬通量。这两种方法具有高度互补性，可以在许多β细胞模型中评估线粒体质量控制时具有灵活性和精确性。

引言

胰腺β细胞产生和分泌胰岛素以满足代谢需求，β细胞功能障碍是 1 型和 2 型糖尿病高血糖和糖尿病发病的原因。β细胞通过线粒体能量和代谢输出将葡萄糖代谢与胰岛素分泌结合，这取决于功能性线粒体质量的储备 ^1,2,3。为了保持最佳的β细胞功能，β细胞依靠线粒体质量控制机制来去除老化或受损的线粒体并保留功能性线粒体质量⁴。选择性线粒体自噬，也称为线粒体自噬，是线粒体质量控制途径的关键组成部分。

活细胞中线粒体自噬的评估通常依赖于线粒体自噬期间发生的线粒体 pH 值的变化。线粒体的 pH 值呈微碱性，健康的线粒体通常位于 pH 值中性的胞质溶胶中。在线粒体自噬过程中，受损或功能失调的线粒体被选择性地掺入自噬体中，并最终在酸性溶酶体中清除⁵.几种体内转基因线粒自噬报告小鼠模型，如 mt-Keima⁶、mitoQC⁷ 和 CMMR⁸，以及可转染的线粒自噬探针，如 Cox8-EGFP-mCherry 质粒⁹....

研究方案

本协议中提出的动物研究已由密歇根大学机构动物护理和使用委员会审查和批准。本研究使用20周龄的雄性C57BL / 6J小鼠，采用15周的常规脂肪饮食（RFD）或高脂肪饮食（HFD）。

1. 通过基于染料的 MtPhagy 方法评估线粒体自噬（方法 1）

1. 小鼠胰岛的制备和处理
   1. 按照以下步骤进行胰岛培养和缬氨霉素暴露。
      1. 按照先前描述的方法^2,10，^从常规脂肪饮食（RFD）或高脂肪饮食（HFD，60kcal%脂肪¹⁹）小鼠中分离胰岛。
      2. 将胰岛样品在37°C下在补充有100单位/ mL抗真菌剂 - 抗生素，50单位/ mL青霉素 - 链霉素，1mM丙酮酸钠，10mM HEPES和10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中过夜（见 材料表）。这种培养基将被称为“胰岛培养基”。
      3. 使用移液管，将每种条件的 100 个胰岛选入 2 mL 胰岛培养基中的 6 cm 培养皿中。
         注：用于本方案的条件：（1）未染色对照：未染色的RFD胰岛;（2）仅DAPI对照：用DAPI染色的RFD胰岛;（3）仅Fluozin-3-AM对照：用Fluozin-3-AM染色的RFD胰岛;....

讨论

该协议描述了两种互补的方法来量化解离的原代小鼠胰岛中的线粒体自噬通量。使用 mt-Keima 方法，线粒体自噬的增加被量化为酸性 （561 nm）/中性 （405 nm） 细胞比率的增加，而在 MtPhagy 方法中，线粒体自噬通量的增加被量化为 Fluozin^高MtPhagy^高TMRE^低 细胞群的增加。这些方法可以对线粒体自噬通量进行快速、定量和β细胞特异性评估。

这两种方法都是?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Attune NxT Flow Cytometer	Thermofisher Scientific	A24858
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermofisher Scientific	D1306	DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder	Equitech	BAH66
Fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108
Fluozin-3AM	Thermofisher Scientific	F24195	100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)	Life Technologies	15140-122	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x	Fisher Scientific	BP399-20	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x)	Life Technologies	11360-070	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]	Anaspec	AS-88061	TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermofisher Scientific	25300054
Valinomycin	Sigma	V0627	Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.