从水样和组织中提取硅藻DNA

摘要

本文介绍了使用改良的通用 DNA 提取试剂盒提取硅藻 DNA 的方案。

摘要

硅藻测试是法医实践中确定尸体是否溺水、推断溺水地点的重要辅助手段。硅藻试验也是环境和浮游生物领域的重要研究内容。以硅藻DNA为主要研究对象的硅藻分子生物学检测技术是一种新的硅藻检测方法。硅藻DNA提取是硅藻分子检测的基础。目前，常用用于硅藻DNA提取的试剂盒价格昂贵，增加了开展相关研究的成本。本实验室对通用全血基因组DNA快速提取试剂盒进行了改进，获得了满意的硅藻DNA提取效果，从而为相关研究提供了一种经济实惠的基于玻璃珠的DNA提取解决方案。使用该方案提取的硅藻DNA可以满足许多下游应用，例如PCR和测序。

引言

在法医实践中，确定尸体是在水中溺水还是死后被扔进水里，对于案件的妥善解决至关重要¹.这也是法医学实践中亟待解决的难题之一².硅藻在自然环境中（尤其是在^{水中）含量}丰富^3,4。在溺水过程中，由于缺氧和应激反应，患者会出现剧烈的呼吸运动，吸入大量的溺水液。因此，水中的硅藻随溺水液进入肺部，一些硅藻可以通过肺泡-毛细血管屏障进入血液循环，并随着血流扩散到内脏器官^5,6。在肺、肝和骨髓等内部组织和器官中检测到硅藻是死前溺水的有力证据 ^7,8。目前，法医硅藻测试主要基于形态学测试方法。在对组织进行一系列预消化后，在显微镜下对未消化的硅藻进行形态定性和定量估计。在此期间，需要使用危险且对环境不友好的试剂，例如硝酸。这个过程非常耗时，需要研究人员具有扎实的分类学专业知识和丰富的经验。这些都给法医人员带来了一定的挑战⁹.硅藻DNA检测技术是近年来发展起来的一种用于硅藻检测的新技术10,11,12。

研究方案

该研究已获得海南医科大学伦理委员会的批准。本研究中使用的组织样本不被视为涉及人类受试者的研究。这些标本是出于法医病理诊断的目的而获得的，其余的用于本实验中硅藻DNA的提取。研究人员无法轻易识别个人以获得相关利益相关者的知情同意。

注：为保证本实验中报告的研究方法的普遍适用性，本实验基本遵循所用试剂盒的操作说明，仅修改了部分步骤。本实验中使用的水样是从实验室附近的池塘中随机采集的（补充图1A）。在该实验中，确认溺水尸体的肺组织为研究组织，以证明提取方案（补充图1B）。在法医实践中，有时还需要使用溺水尸体的其他器官和组织（如肝、脾、肾、骨髓等）来提取硅藻DNA，这需要对这种实验方法进行微小的相应改进，这将在实验的相应章节中解释。该实验中使用的肺组织样本来自法医案件中明显淹死的尸体。已经进行了形态学测试，以证明肺组织含有硅藻（补充图2）。

1.样品的预处理

1. 水样的预处理
   1. 将 10 mL 水样放入离心管中，并以 13,400 x g 离心 5 分钟。用移液管小心弃去 9.8 mL 上清液，并将剩余在底部的约 200 μL 富集硅藻水样品转移到 2 mL 离心管中。
      注意：可以先进行预实验，如果 10 mL 水样不足以富集，可以增加初始量。....

讨论

硅藻细胞受到坚硬的硅质细胞壁¹⁷的保护，必须破坏这种结构才能提取硅藻DNA。普通试剂盒不易破坏硅藻的硅质外壳;因此很难成功提取硅藻DNA²¹。我们的实验室改进了最常用的血液DNA提取试剂盒，在硅藻提取过程中添加了不同直径和不同质量比的玻璃珠。同时进行涡旋振荡，可充分打破硅藻壳，提高硅藻DNA提取效果。如上一份报告²¹所示，玻璃.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binding Buffer	BioTeke	B010006022	rapidly lysing cells
ChemoHS qPCR Mix	Monad	00007547-120506	qPCR Mix
D2000 DNA ladder	Real-Times(Beijing) Biotechnology	RTM415	Measure the position of electrophoretic bands
D512	Taihe Biotechnology	TW21109196	forword primer
D978	Taihe Biotechnology	TW21109197	reverse primer
Elution buffer	BioTeke	B010006022	A low-salt elution buffer washes off the DNA
Glass bead	Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)	70181000	Special glass beads for dispersing and grinding
Import adsorption column	BioTeke	B2008006022	Adsorption column with silica matrix membrane
Inhibitor Removal Buffer	BioTeke	B010006022	Removal of Inhibitors in DNA Extraction
Isopropanol	BioTeke	B010006022	Precipitate or isolate DNA
MIX-30S Mini Mixer	Miulab	MUC881206	oscillatory action
Proteinase K	BioTeke	B010006022	Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Rotor-Gene Q 5plex HRM	Qiagen	R1116175	real-time fluorescence quantification PCR
Speed Micro-Centrifuge	Scilogex	9013001121	centrifuge
Tanon 3500R Gel Imager	Tanon	16T5553R-455	gel imaging
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Thermo Cycler	Zhuhai Hema	VRB020A	ordinary PCR
Wash Buffer	BioTeke	B010006022	Remove impurities such as cell metabolites