一种自动创建稳定且可重现的无细胞间隙的工具，用于提高细胞伤口愈合测定的可靠性

摘要

通过结合交互体验设计和用户需求分析，我们推出了一种创新的细胞刮刀，可在可重复性、可靠性、实用性、细胞完整性和用户体验方面增强细胞伤口愈合测定。

摘要

伤口愈合测定中细胞迁移测量的可靠性经常受到普遍的方法学不稳定性（即基于 tip的方法）的破坏。我们推出了一种旨在解决这些限制的创新工具。我们的新型细胞刮刀超越了目前的方法，产生了更一致和稳定的无细胞间隙。重复的生物实验表明，与基于尖端的技术相比，细胞刮刀产生的无细胞间隙表现出更直的边缘和均匀的大小和形状 （p < 0.05）。在产品设计方面，细胞刮刀拥有适合实验室环境的精致配色方案，增强了对实验结果的监测，并允许通过高压灭菌进行灭菌以供重复使用。值得注意的是，处理后，细胞刮刀对细胞活力和增殖的影响可以忽略不计 （分别为 97.31% 和 24.41%）。相反，基于 tip的方法产生的细胞活力 （91.37%） 和增殖 （18.79%） 较低。这项研究将细胞刮刀描述为一种新颖的、可重复使用的设备，能够在保持细胞活力的同时产生可重复的无细胞间隙，从而与现有技术相比提高了伤口愈合测定的可靠性。

引言

肿瘤具有明显的特征，例如选择性生长优势、代谢重组和免疫调节，所有这些都有趣地促进了细胞迁移的增强，这是肿瘤细胞的一个关键恶性行为。这一特征直接影响原发肿瘤的远处转移，影响患者的长期生存 ^1,2,3。选择性生长优势使癌细胞能够胜过正常细胞，而代谢重新布线通过改变能量途径来支持这种快速增殖。同时，免疫调节使肿瘤能够逃避身体的防御。研究强调了这个问题的严重性，表明肺转移通常是细胞迁移增强的结果，是导致各种癌症患者死亡的终末事件⁴。例如，乳腺癌⁵ 、宫颈癌⁴ 和骨肉瘤⁶ 分别占此类病例的 20%、9% 和 30%。因此，评估肿瘤细胞迁移已成为当前肿瘤学研究不可或缺的一部分，进一步突出了肿瘤进展的多方面性质。

细胞伤口愈合测定是一种易于使用的 体外细胞迁移 方法，通常用于肿瘤学研究⁷。大多数实验者使用移液器吸头手动创建细胞伤口⁸。尽管这种方法可以快速方便地形成细胞伤口，但它仍然存在许多限制，影响评估细胞迁移的可重复性和准确性。首先，使用移液器吸头手动产生划痕受操作者操作角度、力和速度的高度影响，从而影响方法的可重复性⁸。其次，吸头产生的细胞缺陷通常具有锯齿状边缘而不是直边，因为移液器吸头是具有一定弹性的塑料产品⁹。一些研究通过将预制培养小室直接放入细胞培养板中来限制细胞增殖范围¹⁰ 来产生伤口。这种方法规避了基于尖端的方法的限制，例如锯齿状边缘和可重复性。然而，即使使用生物相容性材料，包埋物与细胞的长期共存仍然会影响细胞生长¹¹。此外，由于接触限制，嵌入还可能导致边缘区的细胞表观遗传变化¹²。此外，由生物相容性材料生产的触点插件价格昂贵且难以重复使用，限制了其可行性¹³。因此，需要一种新颖、可重复且实用的工具来轻松量化 体外 细胞迁移。

该方法的主要目标是引入一种创新工具，用于量化肿瘤学研究中 的体外 细胞迁移，解决现有技术的局限性并提高评估细胞迁移的可重复性和准确性。

该技术开发背后的基本原理在于评估肿瘤细胞迁移在肿瘤学中的重要性。肿瘤表现出独特的特征，包括选择性生长优势、代谢重新布线和免疫调节，所有这些都有助于增强细胞迁移，这是癌症恶性肿瘤的一个基本方面。该方法旨在提供更可靠的研究细胞迁移的方法，有助于更深入地了解肿瘤行为。

与现有技术相比，这种方法具有很大的优势。手动划痕检测可能会受到操作员依赖性的干扰，而培养插入片段可能会影响细胞生长和基因表达。相比之下，这种方法提供了更高的可重复性、准确性和实用性，为肿瘤学研究中测量 体外 细胞迁移提供了一种经济高效的解决方案。它满足了对可靠且可访问的工具来研究各种癌症类型中的细胞迁移的迫切需求，使其成为该领域的宝贵补充。

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研究方案

所有参与者都提供了完整的书面知情同意书。伦理批准不适用，因为本研究中未包括动物或人体组织样本。

1. 调查用户社区的需求

1. 向从事细胞伤口愈合测定的生物学家/实验者提供问卷。收集完成的调查问卷并将其用于研究。在这项研究中，从 2021 年 10 月 12 日至 2022 年 2 月 3 日，向 100 名生物学家发送了 100 份问卷。响应百分比为 97%。
2. 让受访者回答以下问题:哪个细胞刮擦实验最困扰您？使用哪种工具进行细胞刮擦？在这些问题后面加上子问题来追踪原因。
3. 研究实验人员对细胞伤口愈合实验中移液器吸头和细胞培养插件等工具的看法。使用问卷第^14,15 节中基于阶梯技术的均值端链理论，了解并收集他们选择一种工具而不是另一种工具的原因。
   注:阶梯法分为两种类型:一种是进行深度访谈的软阶梯法，另一种是采用问卷或纸笔测验¹⁶ 的硬阶梯法。硬阶梯法是本研究中使用的主要技术。均值端链理论认为，目标用户持有的显性知识是肤浅而具体的，而隐性知识是深沉而抽象的 17,18,19。

2. 设计和三维建模

1. 从之前的问卷调查中收集到的见解中绘制草图并启动设计过程。使用此初步草图作为基础蓝图。
   1. 通过在建模软件中应用 Dim、DimRadius 和 DimDiameter 函数来详细说明每个组件的尺寸和布局。
   2. 使用游标卡尺在实际 6 孔板上以 0.02 mm 的精度进行测量，以确定细胞刮刀的最终尺寸。确认这些尺寸为 42.1 mm 长、42.1 mm 宽和 18.5 mm 高。在设计阶段注意细节，尤其是产品高度和井中适度，以便于更顺利的组装。
2. 构建 3D 模型并进行渲染。
   1. 通过创建基本模型，在软件中开始 3D 设计。单击 ExtrudeCrv 等按钮进行拉伸，单击 Loft 等按钮来塑造设计。优化模型，然后单击 FilletEdge 以获得平滑边缘。
      注意:其他使用的功能按钮包括: 线 - 绘制直线段， 折线 - 创建由多个线段组成的连续线， 矩形 - 绘制矩形， 圆 - 绘制圆形， 圆弧 - 绘制弧形或椭圆形， 点 - 放置单点标记， 文本 - 添加文本标签， 尺寸 - 向模型添加测量尺寸， 数组 - 创建对象的复制图案， 旋转 - 将对象旋转到所需角度， 移动 - 将对象移动到新位置， 缩放 - 放大或缩小对象的大小， 修剪/扩展 - 修剪/扩展 - 修剪或扩展对象以符合其他几何图形， 布尔并集/差值/交集 - 合并、减去或查找对象的交集， 图层 - 在不同图层上组织对象， 渲染 - 生成具有材质和照明的渲染视图，以及 导出 - 将模型几何图形导出为其他文件格式。
   2. 将模型导入 3D 渲染软件。应用材质，包括塑料、海绵和钢，然后调整光照以实现逼真的渲染。
      注意:功能按钮的通用列表包括 ，拖放 - 通过将材料从库中拖放到实时视图中所需的组件上，直接将材料应用于零件或模型， 右键单击 - 当右键单击库中的材料时，您通常会看到以下选项: 应用于选择 - 在实时视图中将材料应用于选定的部分。 编辑材质 - 调整材质属性。 材质属性 （选择材质后）- 访问和修改材质的特定属性，例如颜色、粗糙度、折射率和其他属性。搜索栏 - 通过键入材质名称或关联的关键字在库中快速查找材质。 类别/文件夹 - 浏览材质的不同类别或文件夹，如金属、塑料、玻璃等。 添加到收藏夹 - 将某些材质标记为收藏夹，以便在将来的会话中轻松访问。 热键 - 某些操作可以通过热键访问。例如，M 通常是快速调出所选零件的材料属性的热键。
   3. 最后，在照片和设计软件中增强图像的对比度 （+56） 和饱和度（自然饱和度 +19，饱和度 +7），并添加背景元素（文本信息和颜色从白色到浅灰色渐变背景），以确保高质量、逼真的产品表现。
      1. 使用 图像>调整、亮度/对比度来 调整图像的对比度。使用 "图像>色相/饱和度 "可修改图像的饱和度级别。使用 文本工具（T 图标） 将文本信息添加到图像中。
         注意:功能按钮的通用列表包括 椭圆工具 （U） - 绘制点/圆。将工具设置为绘制形状，选择所需的填充颜色，然后单击并拖动（按住 Shift 保持完美的圆圈）以创建一个点。 线条工具 （U） - 在图像上绘制直线。选择工具，设置所需的线宽，然后单击并拖动以绘制线条。 画笔工具 （B） - 绘制点和线的另一种方法。选择画笔大小和形状，然后单击 （对于点） 或单击并拖动 （对于线条）。
3. 完成三维模型后，通过研磨和组装方法 20,21,22 继续生产细胞刮刀。

3. 生产

1. 在当前研究中采用颜色、材料、表面处理 （CMF） 理论来设计细胞刮刀的原型。CMF 理论是科学研究中的一种设计方法。它提高了产品的可用性，塑造了用户感知，并指导了材料的选择 23,24,25。
   1. 从标准颜色系统中选择要用于细胞刮刀的颜色，包括黑色 6 C、冷灰色 6 C 和 11-0601TPG^26,27。
   2. 要构建符合实验室标准的细胞刮刀，请选择合适的材料，包括聚丙烯 （PP）、海绵和高碳钢。对于物理原型的制造，首先使用 3D 打印机生产结构框架。随后，利用连接器或粘合剂完成刮刀的组装。
      注意:要准备细胞刮刀的物理产品，请研磨并组装必要的材料。在整个过程中必须遵循安全协议，以确保最终产品安全有效。
   3. 继续进行精加工过程，这可能涉及切割、研磨、抛光、冲压或其他技术。首先使用中等粒度的 120 粒度砂纸打磨模型，以去除任何粗糙的边缘。
   4. 然后用 220 粒度的细砂纸打磨，以获得光滑的表面。
   5. 后打磨以平滑表面，确保插件或内置连接器正确匹配。
   6. 使用连接器（固定杆）牢固地连接载玻片 I 和 II，以确保细胞刮刀的组装坚固耐用。通过机械紧固和胶粘剂粘接的组合实现细胞刮刀的最终固定形式。使用紧固件，特别是榫卯结构，通过机械力将零件固定在一起。此外，为了提高组件的强度，请使用粘合剂（胶水）以进一步粘合组件。
   7. 将刮刀在 121.3 °C 下高压灭菌 30 分钟，以确保其保持其原始形状和物理特性。

4. 细胞培养

1. 在补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素 - 链霉素的最低必需培养基中培养 HOS 细胞。在 37 °C 和 5% CO₂ 下培养它们。
2. 每 2 天更换一次培养基。
3. 当细胞生长超过 80% 汇合时，加入 1 mL 含 0.25% EDTA 的胰蛋白酶并消化 60 秒。然后，将细胞以 300 x g 离心 5 分钟进行传代培养。去除上清液并加入培养基，使终浓度为 5 x 10⁴ 个细胞/孔。使用自动细胞计数仪进行细胞计数。

5. 评估基于细胞刮刀和尖端的方法的细胞损伤潜力

1. 准备所有受伤材料，并用紫外线照射 30 分钟对其进行消毒。
2. 灭菌后，使用细胞刮刀法或基于吸头的方法，将 100% 汇合的 HOS 细胞以 5 x 10⁴ 个细胞/孔的浓度包裹在 6 孔板中。
   1. 对于基于吸头的方法，使用 100 μL 吸头并将其拖过含有培养基的样品池，水平方向 1 次，垂直方向 1 次。
   2. 对于细胞刮刀方法，将刮刀原型放入其中一个孔中，并在镊子的帮助下轻轻按压一次。细胞受伤。一式三份进行每个伤人实验。
3. 使用数字显微镜系统和成像软件分析所有细胞伤口。

6. 测量细胞活力和细胞增殖

1. 按照 CCK-8 试剂盒中提供的方案进行所有细胞活力测定。
2. 将细胞与 CCK-8 溶液在 37 °C 下孵育 2 小时，然后使用酶标仪测量它们在 450 nm 处的吸光度以量化细胞活力。
3. 设计 5-乙炔基-20-脱氧尿嘧啶 （EdU） 掺入测定，以准确定量 DNA 重复并直接定量细胞增殖比率。按照先前出版物²⁸ 中概述的方案，使用 EdU 测定确定不同方法对细胞增殖产生细胞伤口的影响。
4. 对细胞进行染色并使用数字显微镜系统对其进行成像。确保每个实验一式三份进行。

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结果

剖析用户对生成细胞伤口的工具的需求
目前产生细胞伤口的实验方法需要进一步改进，以解决许多影响细胞伤口愈合测定的生物学可重复性、稳健性、经济消耗和用户体验的问题。我们利用硬阶梯法通过问卷²⁹ 分析参与生物实验的用户的要求（图 1A）。问卷中涉及的信息（例如姓名）是匿名的，以保护他们的隐私。...

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讨论

本研究旨在开发一种用于细胞伤口愈合测定的自动机械化工具。据我们所知，它代表了首次尝试应用机械化驱动结构以一键式方式自动创建细胞伤口。通过这种方式，我们旨在解决传统基于探针的方法的缺点，例如可重复性低和划痕状态不稳定。受益于积极的结果和用户社区的鼓舞人心的反馈，细胞刮刀有望为实验者提供一种高效、稳定的细胞伤口制备方法，从而显著提...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCK-8 Kit	Beyotime Company, China	C0037
digital microscope system	Olympus	IX81
fetal bovine serum	Gibco, USA	16000044
HOS	Procell Life Science & Technology Co., Ltd	CL-0360
Image-Pro Plus	Media Cybernetics	version 6.0
KeyShot	Luxion	version 11.0	3D rendering software
microplate reader	BioTek, German	ELX808
Minimum Essential Medium	Gibco, USA	11095080
Pantone matching system	Pantone		commercial color matching
penicillin-streptomycin	Beyotime Company, China	ST488
Photoshop	Adobe		photo and design software
Rhinoceros 3D	Robert McNeel & Associates	version 7.0	3D design software
TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad	TC20
Trypsin	Cytiva HyClone, United State	SH30042.01