TMEM200A作为泛癌生物标志物的多组学分析

摘要

在这里，提出了一个协议，其中结合了多种生物信息学工具来研究 TMEM200A 在癌症中的生物学功能。此外，我们还通过实验验证了生物信息学的预测。

摘要

TMEM200A，跨膜蛋白已知与人类癌症和免疫浸润有关。在这里，我们通过多组学分析评估了TMEM200A在常见癌症中的功能，并使用胃细胞的体外细胞培养来验证结果。使用UCSC Xena数据库中的RNA-seq数据评估了几种人类癌症类型中TMEM200A的表达。生物信息学分析揭示了TMEM200A作为诊断和预后生物标志物的潜在作用。

培养正常胃细胞系和癌细胞系的培养物，并敲除 TMEM200A 细胞系。采用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法测定 TMEM200A 的表达水平。然后使用 体外 功能丧失研究来确定 TMEM200A 在胃癌 （GC） 细胞恶性行为和肿瘤形成中的作用。Western blot用于评估敲低对GC中上皮-间充质转化（EMT）和PI3K/AKT信号通路的影响。生物信息学分析表明， TMEM200A 在GC中表达水平较高。

TMEM200A敲低抑制了GC细胞的增殖，这也降低了波形蛋白、N-钙粘蛋白和Snai蛋白，并抑制了AKT磷酸化。PI3K/AKT 信号通路似乎也参与了 TMEM200A介导的 GC 发育调节。本文提出的结果表明，TMEM200A通过影响EMT来调节肿瘤微环境。TMEM200A也可能通过PI3K/AKT信号传导影响EMT，从而影响肿瘤微环境。因此，在泛癌，尤其是GC中，TMEM200A可能是一种潜在的生物标志物和癌基因。

引言

癌症已成为一个持续存在的公共卫生问题，危害全球人类健康¹，因为它在世界范围内发病率和死亡率很高，^{给社会带来了}沉重的经济和医疗负担2。近年来，由于癌症标志物³ 的发现，癌症治疗取得了重大进展，研究人员开发了治疗癌症的新诊断方法和新药。然而，由于耐药性、药物副作用和化学敏感性等因素，一些癌症患者的预后仍然较差⁴.因此，迫切需要确定用于筛查和治疗早期癌症的新生物标志物⁵.

膜蛋白是可以结合并整合到细胞和细胞器膜中的蛋白质⁶.根据与膜结合的强度及其位置，这些可分为三类：脂质锚定蛋白、整合蛋白和外周膜蛋白 ^7,8。跨膜 （TMEM） 蛋白是一种完整的膜蛋白，由至少一个跨膜片段⁹ 组成，该片段完全或部分穿过生物膜。

尽管属于TMEM家族的蛋白质的作用机制尚不清楚，但已知这些蛋白质与几种类型的癌症有关¹⁰。几种 TMEM 蛋白与迁移性、增殖性....

研究方案

1. 癌症基因组图谱（TCGA）数据库

注：癌症基因组图谱 （TCGA） 数据库包含不同肿瘤组织中基因的测序数据¹⁴。从UCSC Xena网站¹⁵（https://xenabrowser net/datapages/）中提取TCGA中用于研究百万分之一（TPM）格式TMEM200A转录本的RNA-seq数据，并转换log2以比较样品之间的表达。

1. 转到 UCSC Xena 网站界面。
2. 单击 “启动 Xena ”选项卡。
3. 单击屏幕顶部的 “数据集 ”选项卡。
4. 从本页的 129 个队列和 1,571 个数据集中，单击选项卡，共查看 33 种癌症，例如 GDC TCGA 急性髓系白血病 （LAML）、GDC TCGA 肾上腺皮质癌 （ACC）、GDC TCGA 胆管癌 （CHOL） 等。
5. 从 基因表达 RNAseq 菜单中，选择并单击 HTSeq - FPKM GDC Hub

讨论

TMEM200A 属于 TMEM 家族，对癌细胞增殖至关重要³⁸。不同恶性肿瘤中 TMEM200A 的可变表达受到的关注较少，缺乏彻底的泛癌变研究。然而，越来越多的证据表明，TMEM跨膜蛋白家族可能通过与多种蛋白质的相互作用在保持癌细胞恶性方面发挥重要作用，例如，ROCK1/moesin激活TMEM16A Ca²⁺激活的Cl^- 通道促进BRCA转移³⁹。因此，在目前的工作中，?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody	Proteintech Group, Inc	10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
Anti-snail antibody	Proteintech Group, Inc	13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody	Proteintech Group, Inc	10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit	Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd	UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit	Epizyme Biotech	ZJ101L
CCK-8 reagent	MedChemExpress	HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS)	CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC	FBSSR-01021
GAPDH primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent	ABclonal	RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells	Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX)	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit	Epizyme Biotech	SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit	Epizyme Biotech	PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck KGaA	IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer	Epizyme Biotech	PS108P
RIPA lysis solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010
RPMI 1640 complete medium	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Skimmed milk	Campina: Elk
TBST buffer solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1082
The protein loading buffer	Epizyme Biotech	LT101S
TMEM200A knockdown plasmid	MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody	Proteintech Group, Inc	48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator	Haier Group	PYXE-80IR
Electrophoresis instrument	Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument	Bio-RAD
Gel Imaging System (Tanon 5200)	Tanon Science & Technology Co., Ltd	LAB-0002-0007-SHTN
Multifunctional Enzyme Labeler	Berthold