离体 癫痫 果蝇 模型的钙成像

摘要

在这里，我们提出了一种在表达 GCaMP6 的成年果蝇中进行离体钙成像以监测癫痫样活动的方案。该协议为通过离体钙成像研究成年果蝇的发作事件提供了有价值的工具，从而可以在细胞水平上探索癫痫的潜在机制。

摘要

癫痫是一种以反复发作为特征的神经系统疾病，部分与遗传起源相关，影响全球超过7000万人。尽管癫痫具有临床重要性，但中枢神经系统神经活动的功能分析仍有待开发。成像技术的最新进展，结合遗传编码钙指示剂（如GCaMP6）的稳定表达，在全脑和单细胞分辨率水平上彻底改变了癫痫的研究。黑腹果蝇因其复杂的分子遗传学和行为分析而成为研究癫痫分子和细胞机制的工具。在这项研究中，我们提出了一种新颖有效的方案，用于在表达 GCaMP6 的成年果蝇中进行离体钙成像以监测癫痫样活动。整个大脑由众所周知的癫痫基因 cac 制备，敲低苍蝇用共聚焦显微镜进行钙成像，以识别神经活动，作为爆炸敏感癫痫样行为测定的后续行动。与野生型苍蝇相比，cac敲除果蝇表现出更高的癫痫样行为和异常钙活性，包括更多的大尖峰和更少的小尖峰。钙活性与癫痫样行为相关。该方法在细胞水平上筛选癫痫致病基因和探索癫痫的潜在机制方面是一种有效的方法。

引言

癫痫是一种复杂的慢性神经系统疾病，其特征是自发性和无诱因性癫痫发作的复发以及神经元网络活动异常，已影响全球超过7000万人，使其成为最常见的神经系统疾病^之一1，并导致家庭和社会的沉重负担。考虑到癫痫的影响，已经进行了许多研究以确定癫痫发作的病因，其中遗传学已被批准为许多类型的癫痫或癫痫综合征^{的主要原因2}。在过去的几十年里，基因组技术的进步导致新的癫痫相关基因的发现迅速增加，这些基因在癫痫发作中起着至关重要的作用，包括离子通道和非离子通道基因^3,4。然而，基因和癫痫表型之间的潜在机制和功能分析尚不完全清楚。鉴定癫痫相关基因和机制为有效管理患者提供了可能性^5,6。

胞质钙信号是神经元活动和突触传递的关键元件。自 1970 年代以来，钙成像（包括脑切片⁷、体内^8、9 和 ex 体内¹⁰）已被用于监测神经元活动<....

研究方案

1. 爆炸敏感测定方案

1. 通过Gal4/UAS系统²¹将tub-Gal4驱动线与UAS-cac-RNAi线交叉，建立实验果蝇。收集tub-Gal4系的处女果蝇和UAS-cac-RNAi系的雄性果蝇。然后，将处女苍蝇和雄性苍蝇转移到同一个小瓶中以收获后代。
   注意： tub-Gal4 驱动系将允许实现 cac 基因的全局敲低。使用 UAS-cac-RNAi 系作为对照组。
2. 闭合3-5天后，使用100%CO₂ （CO₂ 麻醉设备）轻轻麻醉苍蝇，并用刷子收集 tub-Gal4>UAS-cac-RNAi 苍蝇和 UAS-cac-RNAi 苍蝇。在测试前 1 天将这些苍蝇转移到新的、干净的食品瓶中，以确保它们做好充分准备。
3. 使用 CO₂ 轻轻麻醉苍蝇。麻醉后，小心地将4-6只苍蝇放入单个新鲜小瓶中。在进行测试之前，让苍蝇从麻醉中恢复约1小时。
   注意：对于每种基因型，至少测试了五项试验，每项试验由六瓶果蝇组成。
4. 设置录音设备。将相机（720-1080P，至少 30-60 FPS，自动对焦锁定）放在白板前的三脚架上。使用空瓶手动调整相机的焦距，以确保清晰....

结果

使用该方案，我们发现 cac 敲低果蝇表现出明显高于WT果蝇的癫痫样行为率（17.00±2.99 [n = 6] vs 4.50 ± 2.03 [n = 6]; P = 0.0061;学生的 t 检验， 图 1A）。大多数tub-Gal4>UAS-cac-RNAi 果蝇在1-5秒内恢复，而 UAS-cac-RNAi 果蝇在2秒内恢复。1 s内 cac 敲除果蝇的回收率显著低于WT果蝇（88.08±1.89 [n = 6] vs 96.50 ± 1.82 [n = 6]）; P = 0.009.......

讨论

钙离子是关键的第二信使，在对化学和电扰动的一系列生理和病理生理反应中起着关键作用。此外，由人CACNA1A基因编码的突触前 P/Q 通道的拓扑元件已被确定为负责介导各种神经递质（包括谷氨酸^30,31,32）的放电，并且与癫痫^{密切相关 33,34}。以前，Cac 敲除果蝇的行为没?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brushes	Panera	AAhc022-2	for handling flies
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C4901
Confocal microscope	SP8; Zeiss, Jena, Germany.	N/A	for calcium imaging
CO2 anesthesia machine	N/A	N/A	for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder	N/A	N/A	handmade, for mounting the brain
Culture vials	Biologix	51-0500	2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	version: 2.14.0	for analysis
Fly morgue	N/A	N/A	handmade, for handling flies
Fly stocks	cac-RNAi	27244	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	GCaMP6m	42750	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	tub-Gal4	N/A	from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
High-resolution camera	N/A	N/A	for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M1028
Papain suspension	Worthington Biochemical	LS003126
Petri dishes	Sigma-Aldrich	SLW1480/02D	for dissection
Pipette	Thermo Scientific	4640010, 4640030, 4640050, 4640060	for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P4504
Recording dish	Thermo Scientific	150682- Glass Based Dish	for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S8282
Stereo-binocular microscope	SHANG GUANG	XTZ-D	for handling flies and dissection
Syringe needles	pythonbio	HCL0693	for dissection
Tripod	WEIFENG	45634732523	for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer	Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich	Z653438	for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard	N/A	N/A	handmade, foam pad or paper for background