从新鲜和冷冻实体瘤标本中优化细胞核分离，用于多组学测序

摘要

该方案提供了一种可靠且优化的方法，可使用 10x Genomics 平台从实体瘤标本中分离细胞核进行多组测序，包括组织解离条件、单细胞悬液的冷冻保存和分离细胞核的评估建议。

摘要

多组测序提供同细胞/配对的单细胞 RNA，以及具有测序（ATAC 测序）数据的转座酶可及染色质测定，代表了我们辨别肿瘤细胞异质性的能力的突破——这是目前转化癌症研究的主要焦点。然而，使用这种先进方式获取的测序数据的质量在很大程度上取决于输入材料的质量。

需要优化酶切条件，以在不牺牲质量的情况下最大限度地提高细胞产量。这在具有致密结缔组织增生基质的实体瘤中尤其具有挑战性，这些基质必须被轻轻分解才能释放细胞。从实体瘤组织中新鲜分离的细胞比从细胞系中分离的细胞更脆弱。此外，由于分离的细胞类型是异质的，因此应选择条件来支持总细胞群。

最后，必须根据裂解时间和试剂类型/比例等这些特性优化核分离条件。在本文中，我们描述了我们在 10x Genomics 多组测序平台从实体瘤标本中进行核分离的经验。我们提供组织消化、单细胞悬浮液储存（如果需要）以及细胞核分离和评估的建议。

引言

随着我们对肿瘤生物学知识的增长，分析肿瘤微环境中异质细胞的重要性也有所增加 ^1,2。以配对细胞方式（多组测序）从同一细胞获取单细胞 RNA 和使用测序（ATAC 测序）数据检测转座酶可及染色质的能力为实现这一目标提供了重大进展 ^3,4。然而，这些实验既昂贵又耗时，所获得数据的质量和影响在很大程度上取决于实验条件和材料的质量。细胞核分离的标准化方案已发表 ^5,6。新鲜和异质组织需要方案优化，因为从实体瘤标本中新鲜分离的细胞比从细胞系中分离的细胞更脆弱。

另一个考虑因素是，对于实体瘤，手术标本通常要到当天晚些时候才能从手术室获得。因此，在没有冷冻保存步骤的情况下，直接从样品采集到细胞核捕获通常是不可行的。根据我们的经验，冷冻单细胞悬浮液可产生最高质量的细胞核（而不是快速冷冻的整个组织或其他保存方式）。对于具有高RNase含量的酶组织类型（如胰腺）尤其如此。

还需要设计组织消化条件，以便在不牺牲质量的情况下最大限度地提高细胞产量⁷。....

研究方案

人类胰腺癌（胰腺导管腺癌）样本是根据 IRB 批准的方案在我们的实验室中采集的。获得患者组织采集的知情同意书。将组织从手术室运送到实验室，然后按如下方式处理。

1.组织解离（消化）

1. 准备消化缓冲液（参见 材料表）。
2. 肿瘤切除后尽快获得感兴趣的组织，并将标本在淬灭缓冲液（含~5%胎牛血清的DMEM F-12）或冰上的1x PBS中运输。
3. 在90mm培养皿中，使用干净的镊子和剪刀在3-5mL消化缓冲液中切碎组织（图2A）。
4. 将切碎的组织转移到50mL锥形管中，并使用具有振荡功能的水浴或干搅拌器在~10mL消化缓冲液中解离30分钟。
5. 从搅拌器中取出，用~20 mL淬火培养基淬灭。通过100μm细胞过滤器将溶液过滤到干净的锥形管中。
6. 从过滤器中收集任何剩余的固体组织（如果需要，重新切碎剩余的组织块），并在37°C下再放入~10mL新鲜消化缓冲液中30分钟。重复直到所有肿瘤组织都解离。
7. 将池细胞悬浮液等分试样并通过 70 μm，然后用 40 μm 细胞过滤器过滤到冰上的干净锥形管中。
8. 在4°C下离心至500× g 沉淀细胞5分钟，然后倾析上清液。

讨论

解开肿瘤微环境中存在的异质细胞群是癌症生物学的一个活跃关注领域。同样，复杂组织存在于良性病理中，例如伤口愈合和纤维化。多组测序已成为一种强大的工具，可以获取同细胞配对的scRNA和ATAC-seq数据。该协议描述了细胞核的分离，这需要在处理新鲜，脆弱，小肿瘤标本的环境中进行优化。在这里，我们提供了从结缔组织增生性实体瘤组织标本中分离细胞核的方案。我们发现这种方法即使.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers	ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	2000153/2000207
Bambanker	Wako, Fisher Scientitic	NC9582225
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	499609
Collagenase (Collagenase Type IV)	ThermoFisher	17104019
Digitonin	Thermo Fisher	BN2006
DNase I	Worthington	LS006330
DTT	Sigma Aldrich	646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12	Thermo Fisher	11320082
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer	Sigma Aldrich	BAH136800040
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution	Sigma Aldrich	11191
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit
NaCl	Sigma Aldrich	59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
Nonident P40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
Poloxamer 188	Sigma	P5556
Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335399001
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T2194
Tween-20	Thermo Fisher	85113