小鼠肺静脉心肌套的显微解剖和免疫荧光染色

摘要

该方案展示了小鼠肺静脉的显微镜引导分离和免疫荧光染色。我们制备包含左心房、肺静脉和相应肺的组织样本，并对它们进行心脏肌钙蛋白 T 和连接蛋白 43 染色。

摘要

肺静脉 （PV） 是房性心律失常中异位搏动的主要来源，在心房颤动 （AF） 的发生和进展中起着至关重要的作用。PV 包含由心肌细胞组成的心肌套管 （MS）。多发性硬化症与心房颤动的发生和维持有关，因为它们保留了与心脏工作心肌的相似性，包括产生异位电脉冲的能力。啮齿动物被广泛使用，并且可能代表研究肺静脉心肌的优秀动物模型，因为心肌细胞广泛存在于血管壁上。然而，由于器官体积小且解剖结构复杂，小鼠 PV 的精确显微解剖和制备具有挑战性。

我们展示了一种显微镜引导的显微解剖方案，用于将小鼠左心房 （LA） 与 PV 一起分离。 使用心脏肌钙蛋白-T （cTNT） 和连接蛋白 43 （Cx43） 抗体进行免疫荧光染色以全长观察 LA 和 PV。10 倍和 40 倍放大倍率的成像提供了 PV 结构的全面视图以及对心肌结构的详细见解，特别是突出了 MS 中连接蛋白 43 的存在。

引言

心房颤动 （AF） 是最常见的持续性心律失常¹。心房颤动的患病率进一步增加，预计 2060 年欧洲将有 ~1790 万患者¹。心房颤动在临床上非常重要，因为它是发生心肌梗死、心力衰竭或卒中的重要危险因素，可导致巨大的个人、社会和社会经济负担¹。尽管 AF 已为人所知数十年，但 AF 的病理生理学仍未完全了解²。

早在 1990 年代后期，研究表明肺静脉 （PV） 在启动和维持 AF 方面具有巨大影响，因为它们是触发 AF 的异位搏动的主要来源³。已经证明PV在结构上与其他血管不同。虽然典型的血管含有平滑肌细胞，但 PV 的被膜介质也含有心肌细胞⁴。在啮齿动物中，这种心脏肌肉组织普遍存在于整个 PV 中，包括肺内和肺外部分，以及孔口区域⁵。在人类中，PV 还含有心肌细胞，可以在左心房 （LA） 心肌的延伸部分（所谓的心肌套管 （MS）^6,7 内观察到。

MS 与心房心肌⁸ 具有形态相似性。心房和 PV 心肌细胞的形状和大小彼此之间没有显着差异，并显示出可比的电生理特性⁸。PV 内的电生理记录证实了 MS 的电活动，血管造影成像显示收缩与心跳同步 ^9,10。

间隙连接是由六个连接蛋白亚基组成的成孔蛋白复合物，它们允许离子和小分子^通过11。间隙连接存在于细胞间对置中，使相邻的心肌细胞互连，并使心肌细胞之间的细胞间电偶联^{成为可能 12,13}。几种连接蛋白亚型在心脏中表达，连接蛋白 43 （Cx43） 是在心脏¹⁴ 的所有区域表达的最常见的亚型。先前的研究为 Cx43 在 PV 的心肌细胞中的表达提供了证据^15,16。

由于其脆弱的结构，在完整的 PV 中研究 MS 仍然具有挑战性，尤其是在小动物模型中。在这里，我们演示了如何使用显微镜引导的显微切割来识别和分离小鼠的 PV 以及 LA 和肺叶。此外，我们还演示了 PV 的免疫荧光 （IF） 染色，以可视化 PV 内的心肌细胞及其相互连接。

研究方案

动物护理和所有实验程序均按照慕尼黑路德维希-马克西米利安大学动物护理和伦理委员会的指南进行，所有使用小鼠的程序均获得 Regierung von Oberbayern （ROB 55.2-2532） 的批准。Vet_02-20-215，ROB 55.2-2532。Vet_02-18-46，ROB 55.2-2532。Vet_02-19-86，ROB 55.2-2532。Vet_02-21-178，ROB 55.2-2532。Vet_02-22-170）。C57BL6/N小鼠是商业化获得的。

1. 准备工作

1. 通过在 500 mL 锥形瓶中混合 3 mg 琼脂糖和 100 mL 1x Tris 缓冲盐水来制备 3% 琼脂糖凝胶。在微波炉中以600W加热溶液2-3分钟，直到凝胶变得均匀。
2. 通过将凝胶轻轻倒入直径为100毫米的培养皿中来准备解剖皿。用凝胶填充培养皿的一半。清除凝胶中的气泡，以确保均匀的稠度。让解剖皿冷却，直到凝胶变成固体。
3. 根据 表1中提供的配方制备所需的所有缓冲液和溶液，包括固定溶液，透化溶液，封闭缓冲液和洗涤缓冲液。

2. 器官摘取和组织制备

注意：详细说明小鼠麻醉和收获心脏程序的广泛协议先前已发表^17,18。因此，我们只对这部分进行简要描述。在12至16周龄的C57BL6小鼠（6只雄性，4只雌性）上进行实验。男性的体重从26克增加到28克，女性的体重从19克增加到22克。以下步骤是在没有事先全身注射肝素的情况下进行的。

1. 用异氟醚（5%，95%氧气，流量：1L / min）麻醉小鼠并确保足够的麻醉深度。
2. 将鼠标转移到操作台上，将其置于仰卧位。通过麻醉面罩吸入异氟醚（2%，98%氧气，流量：1L / min）维持麻醉，并用胶带固定小鼠的四肢。注射芬太尼镇痛（腹腔注射 0.1 mg/25 g 体重）。
3. 在xiphoid突起毛，并设置横向2毫米切口。使用钝解剖术（剪刀背面）将皮毛与皮下筋膜断开，并向颅骨和横向延伸切口以暴露胸部。
4. 小心地打开腹部尾部到肋弓。稍微抬起膈肌突，从尾部切开横膈膜，使肺部塌陷。然后，在不伤害任何器官的情况下从左向右切开横膈膜，双侧打开胸部以暴露心脏。
5. 在心脏仍在跳动时切开下腔静脉（IVC）以对小鼠进行放血，并通过用27G针头穿透左心室并注射10mL冰冷的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）来灌注心脏。
6. 清除小鼠心脏中的血液后，找到主动脉弓、上腔静脉 （SVC） 和气管。将它们切成心脏基底上方 ~3 毫米，然后收获心脏和连接的肺。
7. 将收获的器官浸没在含有 2 mL 灭菌 30% 蔗糖溶液的 10 mL 锥形管中。让样品在4°C下脱水24小时。

3. 显微镜引导下LA和PV的制备

1. 将脱水的心脏和肺放入含有 40-50 mL 1x PBS 的解剖皿中。将其置于 10 倍放大倍率的明场显微镜下并设置照明。将心脏及其背面放在解剖皿上。确定心室壁和心房壁之间的过渡，并使用手术剪刀小心地将心室与心房分开。
   注意：在心房下方切开约 1 毫米以保留一些心室组织。稍后需要将心房固定在解剖皿上，而不会损坏心脏底部的结构。我们建议保留心室，因为它们可以用作阳性对照样本。要包埋心室组织，请遵循与包埋 PV 相同的程序，如第 4 节所述。
2. 将分离的心房与心室切割表面（步骤3.1）放在解剖皿上，使心脏底部朝上。定向心房，使肺叶位于后部，左心耳和左心耳 （LAA） 位于右侧，右心房 （RA） 和右心耳 （RAA） 位于左侧。通过将剩余的左心室组织固定在解剖皿上来固定制剂。轻轻展开肺叶，不要施加过大的力，并将它们固定在解剖皿上（图1A）。
3. 大致了解心脏底部的解剖标志。
   1. 找到主动脉弓位于心脏底部的中心。
   2. 直接检测主动脉右侧的肺干 （PT），并沿其向后部的路线区分肺动脉 （PA）。通过沿着它们的路线向上到达左肺叶和右上叶/中叶来验证它们的位置，以找到相应的肺门 （LH）。
   3. 确定位于主动脉后方的气管和/或左右主支气管（L Br，R Br）的位置，并通过沿着它们朝向LH的路线来验证它们的位置（图1A）。
   4. 找到主动脉左侧的 SVC，并沿着其路线进入 RAA 旁边的 RA 进行验证。
4. 去除心脏底部周围的结缔组织和脂肪组织，同时保留上述所有已识别的标志。此外，切除主动脉弓和气管，以自由观察心脏底部（图1B）。
5. 使用细镊子通过钝解剖将 PA 与心房的上表面轻轻分离。之后，在 LH 处将它们切断并将它们翻转到一边，以露出左心房游离壁 （LAFW） 和 PV 的全尺寸。从LH上切下主要支气管并去除支气管组织（图1C）。
   注意： LH 既是 PA 和气道进入肺部的共同入口点，也是 PV 的出口点。在 LH 仔细执行每个程序以避免对 PV 造成任何损坏非常重要。
6. 要分离 LA/RA 和左心室和右心室（LV、RV），请从剩余 RV 的前部开始，向上穿过三尖瓣 （TV） 直至 SVC 的前侧，从正面打开 RA。切开房间隔旁边的后 RA 游离壁 （RAFW），将 RA 和 LA 分开。切开室间隔旁边的右心室后壁，以完全切断左心室和右心室。
   注意：详细描述了右心房的准备和隔离程序的广泛协议之前已经发表过¹⁹。RA 的分离有助于从 LA-PV 组织复合物中去除不需要的组织并收集组织以进行其他实验。
7. 通过切除一些基底肺组织来减小肺叶的大小，从而留下大约 3-4 毫米的肺组织。
   注意：保留肺叶的顶端，因为它们在随后的包埋步骤中用作浮子，并允许将 PV 水平嵌入 OCT 化合物中。

4. 组织包埋

1. 将制剂（包括 LA 和 PV）转移到冷冻模具中，确保心脏底部和肺尖朝上。将它们排列在生理配置中 - 确保 PV 不扭曲或翻转。
2. 用 O.C.T 化合物填充冷冻管，并用细镊子轻轻压缩 PV 以去除任何残留的空气。在整个过程中保持其生理结构不变。
3. 将带有包埋组织的冷冻剂放在干冰上以冷冻O.C.T.化合物。将样品储存在-80°C以备将来使用。
   注意： 将 PV 保持在水平位置至关重要，以确保获得包含全长 PV 的部分以供后续程序使用。

5. 冷冻组织切片的切割和收集

注意：为了切割组织块，将机器设置调整为-18°C的试样温度和-25°C的刀片温度。

1. 通过在组织块和标本支架之间涂上一层 O.C.T. 化合物，在标本支架上安装组织块。冷冻3-4分钟。
2. 通过关闭试样卡盘释放杆，堵塞试样头并将组织块装入试样头上的试样支架。使用微调旋钮微调组织块的位置。
3. 从试样中取出冷冻模具。疏通试样头和低温恒温器的电制动器。
4. 将低温恒温器设置为微 调模式 ，微调尺寸在 30 μm 和 50 μm 之间。修剪组织标本，直到PV变得可见。
5. 切换到 精细切片模式 并将 厚度 设置为 10 μm。开始收集切片，包括 PV 以及连接的肺和心房组织。使用防滚板收集部分，或用细冷刷将每个部分的自由端固定在刀片支架上并将它们摊开。
6. 将载玻片（保持在室温下）放置在切片附近。小心地将切片从刷子上松开，让切片自然粘附在载玻片上，因为冷冻切片和 O.C.T. 化合物在接触较温暖的载玻片表面时会熔化。
   注意： 在切片过程中保持稳定和温和的状态，以防止切片出现任何破裂或折叠。如有必要，请更换新刀片。
7. 每张幻灯片上最多收集三个部分。标记载玻片并将其储存在-20°C。
   注意：我们建议为每个 PV 收集至少五个部分（相当于两张幻灯片）。

6. PV冷冻切片的免疫荧光染色

1. 将冷冻载玻片安排在染色系统上，并让切片在室温下解冻约20分钟。
   注意：用水填充染色系统以保持样品湿润。组织干燥会损伤抗原，导致非特异性抗体结合和染色过程中的过度染色伪影。
2. 解冻20分钟后，用几滴固定溶液（4%多聚甲醛[PFA]， 表1）覆盖切片，以在室温下将组织固定在载玻片上10分钟。
3. 固定后，将载玻片转移到垂直载玻片架上，并将它们浸入装有 1x PBS 的容器中。将容器低速放在摇床上，洗涤载玻片5分钟。再重复此洗涤周期两次，每次使用新鲜的 1x PBS。
4. 洗涤后，用含木二酚的液体阻滞笔圈出每张载玻片上的每个部分。在染色系统上重新排列载玻片，并用巴斯德移液管将1或2滴透化溶液（0.1%Triton X-100， 表1）施加到每个样品上。让切片在室温下孵育10分钟，以透化细胞和细胞器膜。
5. 透化后，按照步骤6.3中描述的相同步骤，在1x PBS中洗涤载玻片3×5分钟，除去0.1%Triton X-100溶液。
6. 洗涤后，在染色系统上重新排列载玻片，并在每个部分上滴1或2滴封闭缓冲液（表1），确保它们完全被封闭缓冲液覆盖。让载玻片在室温下孵育1小时。
7. 将 5 μL 小鼠抗 cTNT 抗体（1：200 稀释）和 1 μL 兔抗 Cx43 抗体（1：1,000 稀释）移液到装有 994 μL 封闭缓冲液的 1.5 mL 微量离心管中，制备 1 mL 一抗混合物。上下移液，确保充分混合。
   注意：根据切片的大小调整施加的抗体混合物的量。确保切片完全被抗体混合物覆盖。抗体的浓度、孵育时间和最佳孵育温度可能因抗体类型、抗体克隆和组织特性等因素而异。我们建议针对每种抗体单独测试和优化染色条件。
8. 在封闭步骤（步骤6.6）之后，取出剩余的封闭缓冲液，并将2或3滴一抗混合物直接涂在每个切片上。让载玻片在4°C下孵育过夜。
9. 一抗孵育后，在轻轻摇动下用洗涤缓冲液洗涤载玻片 3 x 5 分钟（表 1）。
10. 通过将 1 μL AF488 偶联的山羊抗小鼠二抗（稀释 1：1,000）和 1 μL AF568 偶联的山羊抗兔二抗（稀释 1：1,000）移液到装满 998 μL 洗涤缓冲液的 1.5 mL 微量离心管中，制备 1 mL 二抗混合物。上下移液以充分混合。
11. 洗涤步骤（步骤6.9）后，在染色系统中重新排列载玻片，并用移液管将2或3滴二抗混合物涂抹在每个切片上。让抗体在室温下孵育 45 分钟，同时保护样品免受光照，以防止荧光团淬灭。二抗孵育后，在轻轻摇动下用洗涤缓冲液洗涤载玻片3×5分钟（表1）。
12. 在染色系统上重新排列载玻片。用 Hoechst-33342（在 1x PBS 中以 1：1,000 的稀释度）对切片进行复染，方法是在每个切片上滴入 2 至 3 滴 Hoechst-33342 溶液。让载玻片在室温下孵育10分钟。
13. 孵育后，在轻轻摇动下用洗涤缓冲液洗涤载玻片3×5分钟（表1）。通过在每张载玻片上涂抹 1 或 2 滴荧光封固介质来安装载玻片。用盖玻片盖住载玻片。
    注意： 放置盖玻片时确保盖玻片平整。如果存在任何气泡，请轻轻按压气泡的侧面以将其去除。
14. 将安装的载玻片存放在4°C的载玻片保护器中。
    注意：建议尽早对载玻片进行成像。该协议并非仅适用于上述抗体。靶抗原和抗体可以根据个体实验要求或替代抗原检测策略进行替换或修改。

7. 免疫荧光染色切片的成像

1. 设置显微镜。
   1. 按照制造商的手册使用激光光源、连接的计算机和随附的软件启动显微镜。
   2. 进入 配置 菜单。单击以选择适合荧光成像的相机类型（例如，DFC365FX单色相机）。
   3. 进入 Acquire 菜单并创建 三个通道。
   4. 选择用于检测 Hoechst-33342 的通道 FCr1，对其进行标记，然后在选择部分选择 DAP 过滤器立方体。将曝光时间设置为 200 毫秒，将电子增益设置为 2，将光强度设置为 17%。
   5. 选择用于检测 cTNT（用 AF488 偶联抗体染色）的通道 FCr2，对其进行标记，然后在选择部分选择 L5 滤光片立方体。将曝光时间设置为 200-300 毫秒，将电子增益设置为 1.8，将光强度设置为 100%。
   6. 选择用于检测 Cx43 的通道 FCr3（用 AF568 偶联抗体染色），对其进行标记，然后在选择部分选择 TXR 滤光片立方体。将曝光时间设置为 150 毫秒，将电子增益设置为 2，将光强度设置为 100%。
      注： 表2列出了滤光片立方体的光谱特性。
2. 将载玻片加载到显微镜载物台上。
3. 以 10 倍放大倍率执行概览成像：
   1. 选择 10 倍物镜 ，然后单击 “实时”打开激光快门。选择 FCr1 通道 后，使用 导航器 功能在幻灯片中导航，直到检测到信号。粗略地聚焦样品，直到细胞核可区分。
   2. 启动 螺旋扫描模式 以捕获样品的完整预览。再次单击按钮以保护试样，以 停用活 体。识别 LA、PV 和肺组织。
   3. 定义后续磁贴扫描的感兴趣区域;在感兴趣区域内选择多个焦点。单击 FCr1 通道中的实时，然后调整每个对焦点的焦点。保存相应的 Z 位置，它表示每个对焦点的确切对焦点位置。以 10 倍放大倍率开始平铺扫描，以捕获样品的完整概览图像。
   4. 扫描完成后，打开平铺扫描并合并各个图像。要增强单个通道的亮度和对比度，请在 对象栏 中选择它们，并根据需要使用滑块调整其 信号范围 。
4. 以 40 倍 放大倍率获取放大图像：
   1. 选择 40 倍物镜。调整每个通道的曝光时间和增益设置，如下所示： FCr1：DAP 滤波器立方体：曝光时间：50 毫秒，增益：1.5; FCr2：L5滤波片立方体：曝光时间：80ms，增益：1.8; FCr3：TXR 滤波器立方体：曝光时间：20 ms，增益：2。
   2. 使用步骤 7.3 的概览图像定位 PV 孔口 （PVO） 以及肺外和肺内 PV（PV_ex、PV_in）区域。定义要扫描的此区域。
   3. 打开子菜单 Image 并单击 z 以激活 Z-Stack。
      1. 选择 FCr1 通道 并打开激光快门以获得 实时 预览。
      2. 转到 Z-Stack 子菜单，通过顺时针和逆时针旋转 focus 微调旋钮来确定 Z-Stack 的起点和终点，直到整体信号开始失焦。
      3. 设置对焦范围后，选择 系统优化 的 Z-Stack 模式，然后激活 计算扩展景深图像 （EDF） 选项。根据组织的平整程度，预计大约有 20 层，步进间隔约为 0.5 μm。
   4. 开始磁贴扫描。扫描后，打开平铺扫描并仅合并 EDF 图像。要增强单个通道的亮度和对比度，请在 对象栏 中选择它们，并根据需要使用滑块调整其 信号范围 （请参阅步骤 7.3.4）。
5. 生成图像后，保存项目并将每个图像的合并版本和原始通道导出为 TIFF 文件。
   注意：将文件另存为 ImageJ 可读的 TIFF 允许 ImageJ 以 μm 而不是像素为单位导入原始图块大小。每当不需要激光信号时，请务必关闭激光快门，以防止二抗光漂白。

8. 使用 ImageJ 进行图像编辑

1. 在 ImageJ 中加载相应的原始通道文件。点击 图片 |颜色 |合并 并为每个通道选择所需的 颜色 。
2. 通过选择 “分析”|”工具 |比例条 并将其粘贴到右下角。根据图像要求进行进一步处理和分析。完成后保存合并的图像。

结果

我们对 10 只 12-16 周龄的小鼠进行了 PV 的显微解剖、染色和成像。按照该方案，我们成功地在所有实验小鼠中将PV与LA一起显微解剖，并获得了8只小鼠PV的全面视图。以 10 倍放大倍率拍摄概览图像，以识别 LA-PV 交界处的 PV 孔口 （PVO） 区域、肺外 PV （PV_ex）（肺门和 LA-PV 交界处之间的 PV）和肺内 PV （PV_in）（被肺组织包围的 PV）（图 2）。上述区域的放大图?...

讨论

通过该协议，我们分享了一种区分和分离小鼠心脏PV并对其进行免疫荧光染色的方法。摘取器官后，将心肺在灭菌蔗糖溶液中脱水，然后在显微镜引导下将心室与心房和肺叶分离。之后，准备心脏底座可视化 PV，然后将它们从肺门处的肺部切下。随后使用冷冻技术进行免疫荧光染色，将组织包埋在 O.C.T. 化合物中，用冷冻组切割，然后对 cTNT 和 Cx43 进行免疫荧光染色。

分离 PV ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides	Epredia	10149870
AF568-secondary antibody	Invitrogen	A11036	Host: Goat, Reactivity: Rabbit
Agarose	Biozym LE	840104
Alexa Fluor 488-secondary antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Host: Goat, Reactivity: Mouse
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody	Abcam	ab11370	Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit
Anti-cTNT antibody	Invitrogen	MA5-12960	Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Brush	Lukas	5486	size 6
Cover slips	Epredia		24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70	Epredia		Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C
DFC365FX camera	Leica
DM6 B fluorescence microscope	Leica
Dry ice
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc.	Gibco	14040133	500 mL
Dumont #5FS Forceps	F.S.T.	91150-20	2 pieces needed
Fine Scissors	F.S.T.	14090-09
Fluorescence mounting medium	DAKO	S3023
Graefe Forceps	F.S.T.	11052-10
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Cell nuclei counterstaining
ImageJ	FIJI		analysis and processing software
LAS X	Leica		Imaging software for Leica DM6 B
Microtome blades S35	Feather	207500000
Microwave
Normal goat serum	Sigma-Aldrich	S26-M
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583
Paraformaldehyde 16%	Pierce	28908	methanol-free
Pasteur pipettes	VWR	612-1681
Petri dish	TPP	93100	100 mm diameter
Rocker 3D digital	IKA Schüttler	00040010000
Slide staining jars	EasyDip	M900-12
Specimen Molds	Tissue-Tek Cryomold	4557	25 mm x 20 mm x 5 mm
StainTray M920 staining system	StainTray	631-1923	Staining system for 20 slides
Sterican Needle	Braun	4657705	G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol
Student Vannas Spring Scissors	F.S.T.	91500-09
Super PAP Pen Liquid Blocker	Super PAP Pen	N71310-N
Syringes	Braun	4606108V	10 mL
Tris base	Roche	TRIS-RO	component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287