通过联合巩膜过表达和 2D 单轴张力产生诱导多能干细胞衍生的 iTenocytes

摘要

本文描述了一种通过产生 iPSC 来源的间充质基质细胞来生产 iTenocytes 的程序，这些细胞具有慢病毒载体和 通过 2D 生物反应器进行单轴拉伸的联合过表达 Scleraxis。

摘要

当今肌腱和韧带修复的挑战需要确定一种合适且有效的细胞疗法候选者，以促进肌腱再生。间充质基质细胞 （MSCs） 已被探索为肌腱修复的潜在组织工程策略。虽然它们是多能的并且在 体内具有再生潜力，但它们的自我更新能力有限，并表现出表型异质性。诱导多能干细胞（iPSCs）可以规避这些限制，因为它们具有高的自我更新能力和无与伦比的发育可塑性。在肌腱细胞发育中，硬化（Scx）是肌腱分化的关键直接分子调节因子。此外，机械调节已被证明是指导胚胎肌腱发育和愈合的核心要素。因此，我们开发了一种方案来封装生物和机械刺激的协同作用，这对于产生肌腱细胞可能是必不可少的。iPSCs被诱导为间充质基质细胞（iMSCs），并通过流式细胞术用经典的间充质基质细胞标志物进行表征。接下来，使用慢病毒载体，将 iMSC 转导至稳定过表达 SCX （iMSC^SCX+）。 这些 iMSC^SCX+ 细胞可以使用 2D 生物反应器通过单轴拉伸加载进一步成熟为 iTenocytes。通过观察早期和晚期肌腱标志物的上调以及胶原沉积来表征所得细胞。这种产生异细胞的方法可用于帮助研究人员开发一种潜在的无限现成的同种异体细胞来源，用于肌腱细胞治疗应用。

引言

为了解决肌腱和韧带修复的当代问题，需要一种适合细胞疗法的相关候选细胞。肌腱修复组织工程的一个研究途径涉及探索骨髓来源的间充质基质细胞 （BM-MSC） 和脂肪组织来源的基质细胞 （ASC） 作为潜在策略。这些细胞在体内具有多能能力、丰度高和再生潜力。此外，它们在动物模型中显示出增强的愈合能力和改善的功能结果¹.尽管如此，这些细胞表现出有限的自我更新能力、表型多样性，尤其是有限的肌腱形成能力。诱导多能干细胞 （iPSC） 技术具有卓越的自我更新能力和无与伦比的发育适应性，因此为这些限制提供了解决方案。我们的研究团队和其他人已经成功地将 iPSC 分化为间充质基质细胞样实体 （iMSC）^2,3。因此，iMSCs有可能成为肌腱细胞治疗应用的同种异体来源。

硬化性 （SCX） 是肌腱发育所必需的转录因子，被认为是分化肌腱细胞最早可检测到的标志物。此外，SCX 激活下游肌腱分化标志物，包括 1a1 型链胶原 1 （COL1a1）、莫霍克 （MKX） 和肌腱调蛋白 （TNMD） 等 ^4,5,6。肌腱成熟过程中表达的其他基因包括促进微管蛋白聚合的蛋白家族成员 3 （TPPP3） 和血小板衍生生长因子受体 α （PDGFRa）⁷。虽然这些基因对肌腱发育和成熟至关重要，但不幸的是，它们并非肌腱组织所独有，而是在其他肌肉骨骼组织（如骨骼或软骨）中表达^5,7。

除了肌腱发育过程中标志物的表达外，机械刺激是胚胎肌腱发育和愈合的基本要素 ^4,5,6。肌腱具有机械反应性，其生长模式会随着环境而变化。在分子水平上，生物力学线索影响肌腱细胞的发育、成熟、维持和愈合反应⁸.各种生物反应器系统已被用于模拟生理负荷和生物力学线索。其中一些模型系统包括离体组织加载、施加双轴或单轴张力的 2D 细胞加载系统以及使用支架和水凝胶的 3D 系统 ^9,10。在细胞命运的背景下研究机械刺激对肌腱特异性基因或细胞形态的影响时，2D 系统是有利的，而 3D 系统可以更准确地复制细胞-ECM 相互作用 ^9,10。

在 2D 加载系统中，细胞和培养底物之间的应变是均匀的，这意味着可以完全控制对细胞细胞骨架施加的负载。与双轴载荷相比，单轴载荷在生理上更相关，因为肌腱细胞主要受到体内胶原束的单轴载荷 ⁹。研究发现，在日常活动中，肌腱承受高达6%应变¹¹的单轴拉伸载荷。具体来说，先前的研究发现，在 4%-5% 的生理范围内负荷已被证明可以通过保留肌腱相关标志物表达（如 SCX 和 TNMD）以及增加胶原蛋白的产生来促进肌腱分化 ^9,10。超过 10% 的菌株可能与创伤相关，但在生理上无关^12,13。

在这里，提出了一个方案，该方案考虑了机械和生物刺激的协同作用，这可能对肌腱细胞的产生至关重要。我们首先描述了一种可重复的方法， 通过 胚状体短期暴露于生长因子来诱导 iPSC 进入 iMSC，使用流式细胞术通过 MSC 表面标志物确认。然后，我们详细介绍了一种慢病毒转导方法，以设计iMSCs以稳定地过表达SCX（iMSC^SCX+）。为了进一步成熟细胞，将 iMSC^SCX+ 接种到纤连蛋白包被的硅胶板中，并使用 CellScale MCFX 生物反应器进行优化的单轴张力方案。通过观察早期和晚期肌腱标志物的上调以及胶原沉积¹⁴ 证实了肌腱形成潜力。这种产生异细胞的方法是一种概念验证，可以为肌腱细胞治疗应用提供无限的现成同种异体来源。

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研究方案

该产生 iTenocytes 的方案可以分三个主要步骤进行:iPSC 到 iMSC（10 天），iMSC 到 iMSC^SCX+ （2 周），iMSC^SCX+ 到 iTenocytes（至少 4 天）。协议中的每个主要步骤都可以暂停并在以后重新启动，具体取决于实验时间表。对于涉及细胞培养的方法，应采用无菌技术。该方案中的所有细胞应在37°C，5%CO₂和95%湿度下生长。

1. 人iPSC诱导诱导间充质基质细胞（iMSCs）

1. 实验准备
   1. 制备 Iscove 改良的 Dulbecco 培养基 - 胚状体 （IMDM-EB） 培养基。
      1. 补充 50 mL IMDM 基础培养基，加入 8.5 mL 基因敲除血清替代物、500 μL 最小必需培养基 （MEM） 非必需氨基酸、0.385 μL（110 mM 原液）β-巯基乙醇和 500 μL 抗生素-抗真菌溶液 （AAS）（终浓度:分别为 17%、1%、110 μM、1%）（参见 材料表）。
   2. 制备间充质基质细胞（MSC）培养基。
      1. 用 50 mL 胎牛血清 （FBS）、5 mL 抗生素-抗真菌药溶液 （AAS） 和 5 mL L-谷氨酰胺（终浓度:分别为 10%、1%、2 mM）补充 440 mL 低葡萄糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）。
   3. 制备聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）（poly-HEMA）涂层板。
      1. 将10克聚HEMA加入无菌瓶中（见 材料表）。
      2. 在瓶子中加入磁力搅拌器，在搅拌的同时，缓慢加入 500 mL 95% EtOH。
      3. 加入所有 EtOH 后，以 1200 rpm 的速度打开搅拌模式，并额外低火至少 6 小时。poly-HEMA溶液可在室温下储存长达一年。
      4. 在无菌条件下，向 T75 烧瓶中加入 2.5 μg/^{cm 2} in 9 mL。根据培养容器的大小调节体积。
      5. 保持无菌，让容器风干，使 EtOH 在使用前完全蒸发。这通常需要24-72小时。
   4. 准备明胶包衣的烧瓶。
      1. 用NaOH清洗玻璃瓶，并将其用于明胶制备。不要使用清洁剂。
      2. 准备 1% 明胶溶液（5 g 明胶和 500 mL 无内毒素水）。用明胶溶液高压灭菌玻璃瓶30分钟。
      3. 让明胶溶液冷却，可在室温下储存。
      4. 每个烧瓶涂上 5 mL 明胶溶液的 T75 烧瓶，并在接种细胞前孵育至少 1 小时。明胶包衣的烧瓶可以提前 1 天制备。
   5. 制备荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液。
      1. 将PBS与2%牛血清白蛋白和0.1%叠氮化钠混合。储存在4°C。
2. 胚状体（EBs）的产生
   注意:iPSC 应在 6 孔板中培养，使用前应达到 70%-80% 汇合度。
   1. 在第 0 天，将 384 透明底 PCR 板放入组织培养罩中，并在不盖盖的情况下紫外线 15 分钟。
   2. 从iPSC中除去生长培养基（参见 材料表）并用PBS洗涤孔。
   3. 向每个孔中加入0.5mL预热的温和细胞解离试剂（参见 材料表），并在37°C下孵育5分钟。 每5分钟观察一次细胞，直到iPSC变成单细胞或悬浮液中的小聚集体。
   4. 用 1 mL 移液管重悬细胞悬浮液，以确保单细胞悬液。
   5. 在室温下以300× g 离心细胞5分钟。
   6. 除去上清液，重悬于IMDM-EB培养基中（步骤1.1.1），并使用血细胞计数器或细胞计数仪计数活细胞。
   7. 计算每孔 384 孔板每孔 5,000-25,000 个细胞所需的适当体积，每孔 25 μL 细胞悬液。
      注意:通常，6 孔板的 2-3 个汇合孔 （70%-80%） 可以在一个 384 孔板中产生 EB。每个 EB 的单元大小将根据经验确定。对于整个 384 孔板，必须使用 9.6 mL 细胞悬液，每孔 25 μL。
   8. 在室温下再次以300× g 离心细胞5分钟。
   9. 除去上清液，将细胞重悬于适当体积的IMDM-EB培养基和10μM盐酸Y-27632二盐酸盐（原液:10mM，1000x，参见 材料表）中，置于预冷的15mL锥形管中。
   10. 向锥形中加入冷溶性基底膜基质（每384孔板EB值1mg）（参见 材料表）。
   11. 将 25 μL 细胞悬液分配到每个孔中。将无菌盖放在平板上，并在4°C下以450× g 旋转7分钟。在37°C孵育48小时。
   12. 在第 2 天，将细胞转移到装有 3 mL 预热的 IMDM-EB 培养基的 100 mm 板中。
   13. 将 EB 转移到装有 10 mL IMDM-EB 的专用聚 HEMA 包被 T75 烧瓶中。根据培养容器的大小调节体积。让 EB 生长 3 天。
   14. 在第 5 天，将 EB 转移到装有 10 mL IMDM-EB 培养基的制备明胶包被的 T75 烧瓶中。根据培养容器的大小调节体积。将 EB 悬浮 3 天以上。
   15. 在第 8 天，确保观察到两种类型的 EB:附着在烧瓶上的 EB 和未附着的 EB。用PBS从烧瓶中洗掉未连接的EB。
   16. 向附着的EB中加入补充有TGFβ-1（10ng / mL）的IMDM-EB培养基（参见 材料表），并让它们生长2天。
   17. 在第 10 天，将培养基更换为 MSC 培养基。细胞应每周喂养两次。一旦 70% 汇合，请继续执行"标准提升细胞方案"以重新铺板细胞。将细胞重新铺在明胶包被的平板上。
3. 标准提升单元方案
   1. 一旦贴壁细胞达到70%汇合，从板中吸出生长培养基并用PBS洗涤。
   2. 通过向每个150mm板中加入5mL预热的0.25%胰蛋白酶来提升细胞，并在37°C下孵育5分钟。 根据培养容器的大小调整胰蛋白酶体积。
   3. 在显微镜下，检查大多数细胞是否已从每个板上取出。如果仍有细胞附着，请轻轻敲击板的侧面以去除细胞。
   4. 通过加入两倍体积的预热生长培养基，将细胞收集到锥形管中。
   5. 在室温下以300× g离心细胞5分钟。取出上清液并继续执行后续步骤。
4. 流式细胞术评估 MSC 标志物表达
   注意:人间充质干细胞，如骨髓间充质干细胞，应用作阳性对照。
   1. 执行"标准提升细胞协议"（步骤 1.3）。
   2. 用 3 mL FACS 缓冲液重悬上清液，并将整个体积转移到 FACS 管中。
   3. 在室温下以300× g离心5分钟。用FACS缓冲液重复洗涤步骤两次。
   4. 向染色管中加入2μL小鼠抗人CD90-FITC，小鼠抗人CD44-APC和抗人CD105-PE（参见 材料表），并在4°C下孵育45分钟。
   5. 向同型对照管中加入 20 μL 小鼠 IgG2a-FITC、小鼠 IgG1-PB 和小鼠 IgG1-PE（参见 材料表）。
   6. 在4°C下在黑暗中孵育15分钟。通过加入3mL的FACS缓冲液并以300× g （室温）离心5分钟来洗涤所有试管。将细胞重悬于每管的 250 μL FACS 缓冲液中。
   7. 使用流式细胞术分析MSCs表面标志物的表达¹⁴.激发和发射波长应为:CD90-FITC，激发峰在495 nm，发射峰在519 nm;CD44-APC，激发峰在640nm，发射峰在660nm;CD105-PE，激发峰在561 nm，发射峰在574 nm。

2. iMSC传代和扩增

1. 试剂的制备
   1. 准备 MSC 冷冻培养基。
      1. 混合 30 mL 低葡萄糖 DMEM、5 mL DMSO 和 15 mL FBS（终浓度分别为 60%、10%、30%）。
      2. 使用无菌的0.45μm过滤器过滤溶液。储存在4°C。
2. 传代
   注意:诱导后，iMSC必须在明胶包被的平板上生长2个额外的通道，然后才能断奶以在塑料组织培养板上生长。此外，当 70% 汇合时，细胞应以 1:3 的分流比传代。
   1. 执行"标准提升细胞协议"（步骤 1.3）。
   2. 将细胞重悬于 MSC 培养基中，并将细胞均匀分布到三个新的 150 mm T175 培养瓶板中，每个培养瓶含有 20 mL 培养基。将细胞返回至37°C。
   3. 每周两次，用预热的MSC培养基代替生长培养基。
3. 冻结
   1. 执行"标准提升单元协议"。
   2. 将细胞重悬于 1 mL MSC 冷冻培养基中。将1mL细胞悬液加入冷冻管中，并在冷冻容器中在-80°C下储存24小时，然后转移到液氮中长期储存。
4. 解冻
   1. 在 15 mL 锥形管中制备 10 mL 预热的 MSC 培养基。
   2. 取回冷冻管，将其浸入37°C水浴中，并旋转直到豌豆大小的冰球剩余（约1-2分钟）。
   3. 在细胞培养罩中，缓慢地将 1 mL 预热培养基加入冻存管中，并上下移液以混合。
   4. 将细胞悬液从冷冻管转移到制备的15mL锥形管中，并用300× g （室温）离心5分钟。
   5. 取出上清液，用新鲜培养基重悬。将细胞悬液加入总体积为 20 mL 的 150 mm 板中。根据培养瓶的大小调节体积。
   6. 将细胞在37°C孵育直至准备分裂。

3. 利用慢病毒转导对iMSC进行基因工程过表达SCX

注意:协议的这一部分需要两周时间才能完成。

1. 培养基和试剂的制备
   1. 制备 HEK293T/17 细胞培养基。
      1. 添加 445 mL Eagle 最低必需培养基 （EMEM） 和 5 mL FBS 和 5 mL AAS（终浓度:分别为 10%、1%）。
   2. 制备 MSC 慢棉包装培养基。
      1. 通过在60°C水浴中加热50mL室温FBS30分钟来制备热灭活血清。
      2. 将 445 mL 低葡萄糖 DMEM 与热灭活的 FBS 和 5 mL L-谷氨酰胺混合（终浓度分别为 10%、2 mM。
   3. 制备转染复合物。
      1. 允许转染复杂组分（参见材料表）在冰上解冻:包装质粒VSV-G和Delta，SCX质粒和BioT^15,16。
      2. 轻轻涡旋并旋转质粒。测量DNA浓度。
      3. 根据 DNA 浓度和用于转染的烧瓶数量，计算所需每种组分的体积:对于一个 T75 烧瓶，转染复合物将包括 750 μL 无血清培养基（如无血清 DMEM 或 PBS）、7.5 μg SCX 质粒、0.75 μg VSV-G 质粒、6.75 μg Delta 质粒和 22.5 μL BioT。考虑额外的移液错误。
      4. 轻轻上下移液混合。在离心机中短暂旋转。在室温下孵育 15 分钟并立即使用。
2. 转染和慢病毒生产
   注意:从第 3 天开始，该协议需要处理慢病毒，因此，必须使用收容等级 2+ 的操作程序进行工作。工人必须穿戴个人防护装备，包括两层手套、腕罩、安全眼镜、口罩、长裤和封闭鞋。所有废物和材料，包括移液器吸头、烧瓶和液体培养基，必须用漂白剂（最终 1% 次氯酸钠）净化至少 20 分钟。请勿使用真空吸尘器。
   1. 接种 HEK293T/17 个细胞。
      1. 转染前约 18-24 小时（第 0 天），将 293T 细胞提起并铺板到 T75 烧瓶中。以下各卷假设 T75 为培养容器。根据所使用的细胞培养容器调整体积。
      2. 从烧瓶中取出培养基，用 5 mL PBS 洗涤。
         注意:细胞很容易从烧瓶表面提起。将PBS添加到烧瓶的侧面，避免直接向细胞中添加溶液。
      3. 向每个烧瓶中加入3mL预热的0.25%胰蛋白酶，并在37°C孵育5分钟。将细胞收集到锥形管中，并在室温下以300× g离心5分钟。
      4. 除去上清液，重悬于293T培养基中，并使用血细胞计数器或细胞计数仪计数活细胞。
      5. 以5.3×10⁴ 个细胞/ cm² 铺板细胞，并在37°C下孵育过夜。
      6. 第二天（第1天），准备转染复合物。用 5 mL 预热的 MSC 扁豆包装培养基替换细胞中的生长培养基（步骤 3.1.2）。
      7. 将转染复合物滴加到细胞中。轻轻倾斜培养皿，以确保转染复合物均匀暴露于细胞中。将细胞放回培养箱48小时。
         注意:应在24小时（第2天）后观察毒性。
      8. 48小时后（第3天），使用移液管小心地将含病毒的培养基收集到单独的锥形管中，并在300× g （室温下）离心5分钟。
      9. 向 293T 细胞的 T75 烧瓶中加入 5 mL 预热的 MSC 扁豆包装培养基，并返回培养箱过夜。
      10. 离心后，用0.45μm无菌过滤器过滤上清液，直接将上清液移液通过过滤器。将含病毒的培养基在4°C下储存过夜。
      11. 再过24小时（第4天）后，再次使用移液管将含病毒的培养基小心地收集到单独的锥形管中，并在300× g （室温下）离心5分钟。
      12. 将病毒与前一个采集日的病毒混合，以确保溶液均匀。此时，协议可以暂停并在以后重新启动，具体取决于实验时间表。慢病毒可以分装并在-80°C下冷冻，或者慢病毒可以储存在冰上，同时进行"用SCX转导iMSCs"（步骤3.3）。
          注意:慢病毒等分试样冷冻和解冻后，不要重新冷冻。
3. 使用 SCX 转导 iMSC
   1. 进行滴度板转导。
      1. 在第 0 天，执行"标准提升细胞协议"。
      2. 将细胞重悬于MSC培养基中，并使用血细胞计数器或细胞计数仪对活细胞进行计数。
      3. 在 6 孔板中，加入 4 x 10³ 个细胞/cm²。将剩余部分重新铺在装有 20 mL MSC 培养基的额外 150 mm 板中（这将是对照板）。将细胞在37°C孵育24小时。
      4. 第二天（第 1 天），细胞应汇合 ~40%。预热慢豆包装生长培养基，并在冰上解冻聚凝胺和约3mL慢病毒（或者如果在病毒收集的同一天进行，则储存在冰上直至使用）。
      5. 根据所需的滴度（即12.5%、25%、50%、75%、100%）将慢颗粒包装生长培养基和慢病毒加入孔中。加入 0.5 μL 聚凝胺，使终浓度达到 5 μg/mL（储备浓度:10 mg/mL，参见 材料表）。
      6. 旋转板以确保均匀暴露于所有细胞。将板在37°C下放回培养箱48小时。
   2. 使用流式细胞术评估 SCX 慢病毒滴度效率。
      1. 48小时后，执行"标准提升细胞协议"。
      2. 将细胞重悬于PBS中，并使用血细胞计数器或细胞计数仪对活细胞进行计数。在室温下以300× g离心细胞5分钟。
      3. 取出上清液，将其重悬于3 mL FACS缓冲液中洗涤。将细胞悬液转移到流式细胞术管中，并以300× g离心5分钟。
      4. 重复FACS缓冲液洗涤两次，并将最终细胞沉淀重悬于300μL的FACS缓冲液中。使用流式细胞术机评估每个滴度的GFP表达。
      5. 根据滴度和细胞活力计数，确定适当的慢病毒滴度以进行转导。此时，协议可以暂停并在以后重新启动，具体取决于实验时间表。
   3. 进行大规模 SCX 转导。
      注意:列出的体积是每个 1x 150 mm 板或 1x T175 烧瓶。这可以根据所需的容器大小和转导规模进行相应调整。
      1. 在第 0 天，执行"标准提升细胞协议"。
      2. 将细胞重悬于MSC培养基中，并使用血细胞计数器或细胞计数仪对活细胞进行计数。以 4 x 10³ 个细胞/cm² 接种细胞。将细胞在37°C孵育24小时。
      3. 第二天（第 1 天），细胞应汇合 ~40%。预热慢豆包装生长培养基，并在冰上解冻聚凝胺和预先计算的慢病毒量。
      4. 根据确定的滴度，向孔中加入所需量的慢颗粒包装生长培养基和慢病毒。加入 5 μg/mL 聚凝胺（储备浓度:10 mg/mL）。
      5. 第3天，在荧光显微镜下观察细胞。新生产的 iMSC^SCX+ 应该会发出 GFP 荧光。用预热的MSC培养基替换含病毒的培养基。此时，协议可以暂停并在以后重新启动，具体取决于实验时间表。

4. iMSC^SCX+ 传代和扩展

1. 按照与 iMSC 相同的方式对 iMSC^SCX+ 进行传代、扩增、冷冻和解冻，如方案的第 2 步所述。

5.机械加载

注意:此部分至少需要 4 天，但可能会更长，具体取决于是否观察到细胞收缩。

1. 实验准备
   1. 准备硅胶板。
      1. 高压灭菌器 2 块硅胶板（见 材料表）。之后，在无菌条件下，从高压灭菌器袋中取出硅胶板并将它们放入 150 毫米板中。
      2. 将 130 μL 纤连蛋白（100x，参见 材料表）与 13 mL 无菌 PBS 在 15 mL 锥形管中混合。将试管倒置数次以混合。
      3. 向硅胶板的每个孔中加入 400 μL 纤连蛋白溶液。将板在37°C下孵育至少2小时或过夜。
      4. 使用前，吸出纤连蛋白溶液，让板在细胞培养罩中风干至少 30 分钟，让纤连蛋白溶液完全蒸发。
         注意:纤连蛋白溶液可以提前从孔中取出，现在包被的板可以在37°C下放置长达数周，直到使用。
   2. 准备 MSC 拉伸介质。
      1. 通过在 15 mL 锥形管中将 140 μL 抗坏血酸（原液:100x，终浓度:50 μg/mL）加入 14 mL 预热的 MSC 培养基中来制备 MSC 拉伸培养基。
         注意:在每次更换培养基之前，必须将抗坏血酸新鲜添加到 MSC 培养基中。
2. 在硅胶板中植入 iMSC^SCX+
   1. 执行"标准提升细胞协议"（步骤 1.3）。
   2. 将细胞重悬于MSC培养基中，并使用血细胞计数器或细胞计数仪对活细胞进行计数。
   3. 计算获得 1.25 x 10⁴ 个细胞/cm² 所需的细胞悬液体积。
   4. 从 15 mL 锥形管中取出此体积的 MSC 拉伸培养基。添加目标单元格。将新的细胞悬液倒置至均质。
   5. 向两个硅胶板的每个孔中加入 400 μL 新细胞悬液。
   6. 将盖子放回150mm板上，并将它们放回37°C的培养箱中24小时。
3. 单轴张力
   1. 第二天，用ddH₂O冲洗拉伸装置（见材料表），然后用70%乙醇冲洗。擦拭设备，将其放入细胞培养罩中，UV15分钟。
   2. 取回接种的板并检查孔是否具有良好的细胞附着。
   3. 将一个板留在培养箱中（静态控制），并通过将螺钉与硅胶板上的孔对齐，将第二种硅胶板放入拉伸装置中。盖上设备的盖子以确保无菌。
   4. 将带有种子硅胶板的设备连接到电子源（参见 材料表）并将其置于37°C的培养箱中。
   5. 在程序上，将循环拉伸方案设置为 4% 正弦应变，0.5 Hz，每天 2 小时 。按一次 开始 按钮开始伸展。伸展运动应立即开始。
   6. 将细胞拉伸至少 3 天。每天监测细胞，如果可以观察到细胞收缩，请停止拉伸方案。每隔一天将培养基更换为新鲜的 MSC 拉伸培养基。

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结果

人 iPSCs 分化为 iMSC
如前所述，目前将 iPSC 分化为 iMSC 的方案涉及胚状体² 的形成。这个过程大约需要10天才能从iPSC中诱导iMSC（图1A）。但是，强烈建议将新生成的 iMSC 至少传代两次。这不仅有助于消除对明胶包衣板的需求，而且还建立了稳定的MSC表达。分化后六次传代后进行的流式细胞术定量显示，具有近乎纯的细胞群，具有高表达的经典 M...

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讨论

在该协议中，通过三个主要步骤产生异细胞:（1）将iPSC诱导为iMSC，（2）使用慢病毒载体过表达SCX，以及（3）通过2D单轴张力使细胞成熟。

用于将 iPSC 区分为 iMSC 的方案之前已由我们的第² 组描述过。自该出版物发表以来，已经开发了许多方案，包括在临床试验中使用 iMSC 的既定方案 21,22,23，以及市售的分化试剂盒。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Accutase	StemCell Technologies	7920	cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution	Thermofisher	15240096
Anti-CD105	Ancell	326-050
APC mouse anti-human CD44	BD Biosciences	559942
APC mouse IgG2 K isotype control	BD Biosciences	555745
BenchMark fetal bovine serum	GeminiBio	100-106
Biglycan	Thermofisher	Hs00959143_m1
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Thermofisher	11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM)	ATCC	30-2003
Fibronectin bovine plasma	Sigma Aldrich	F1141
FITC mouse anti-human CD90	BD Biosciences	555595
Gelatin from porcine skin	Sigma Aldrich	G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE	Bio-Rad	STAR117
HEK 293T/17	ATCC	CRL-11268
IMDM, no phenol red	Thermofisher	21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1	Cedars-Sinai iPSC Core Facility	N/A	https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC	Miltenyi Biotec	130-113-271
KnockOut serum replacement	Thermofisher	10828010
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A4544
L-Glutamine	Thermofisher	2503081
Matrigel	Corning	354230	basement membrane matrix
MechanoCulture FX	CellScale	N/A	stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution	Thermofisher	11140050
Mohawk human Taqman primer	Thermofisher	Hs00543190_m1
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276
PBS	Thermofisher	10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer	Thermofisher	Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)	Sigma Aldrich	192066
Polybrene infection/transfection reagents	Millipore Sigma	TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer	RnD Systems	240-B
Scleraxis human Taqman primer	Thermofisher	Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone	OriGene	RC224305L4
Silicone plates	CellScale	N/A
Sodium azide	Millipore Sigma	S2002
Tenascin C human Taqman primer	Thermofisher	Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer	Thermofisher	Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer	Thermofisher	Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT	Bioland Scientific LLC	B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermofisher	25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3	Thermofisher	Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride	Biogems	1293823