机械分离的基质血管组分和纤维蛋白水凝胶的组合：一种加工方案

摘要

机械分离的基质血管组分 （SVF） 与纤维蛋白水凝胶相结合，为活的脂肪来源的基质细胞提供了一种简单有效的载体，用于各种适应症，包括组织工程和/或伤口愈合目的。在这里，我们介绍了用于转化研究和临床应用的机械 SVF （mSVF）-纤维蛋白水凝胶构建体的制备。

摘要

脂肪来源的基质细胞 （ASCs） 的再生潜力在再生和转化研究中受到广泛关注。过去，从脂肪组织中提取这些细胞需要一个基于酶的多步骤过程，从而产生由 ACS 和其他细胞组成的异质细胞混合物，这些细胞统称为基质血管部分 （SVF）。最近推出的机械 SVF （mSVF） 隔离方案耗时更少，并且绕过了监管问题。 我们最近提出了一种方案，该方案基于乳化和离心的组合生成富含基质细胞的 mSVF。用于伤口治疗应用的 mSVF 应用的当前一个问题是缺少支架，以防止机械操作和干燥。过去，纤维蛋白水凝胶已被证明是用于伤口愈合目的的细胞转移的有用辅助剂。在本文中的工作中，我们描述了 mSVF-纤维蛋白水凝胶构建体的制备步骤，作为转化研究和临床应用的新方法。

引言

在过去的几年里，再生整形手术已成为整形外科的另一支柱¹。再生整形手术旨在通过转移从患者身上采集的可溶性因子、细胞和组织来恢复受损组织，以微创方式促进组织恢复²。脂肪来源的干细胞 （ASC） 因其分化为多个间充质谱系的能力而受到关注，使其成为再生医学研究的有前途的候选者³。它们的细胞因子谱显示血管生成、免疫抑制和抗氧化作用⁴。

传统上，使用胶原酶的酶促方法从脂肪组织中分离 ASC，产生基质血管组分 （SVF），随后培养以获得 ASC。这些基于实验室的技术成本高昂、耗时，而且重要的是，受到严格的监管限制，使临床翻译复杂化 ^5,6,7。相比之下，机械分离的基质血管组分 （mSVF） 方案不仅提供了绕过监管问题，而且最大限度地降低了污染风险的临床优势 ^8,9。

研究方案

这项研究是根据赫尔辛基宣言进行的。所有成年捐献者均提供了书面知情同意书，以允许进一步使用收集的组织样本。该协议遵循我们机构人类研究伦理委员会的指导方针。

1. 脂肪组织的收获

1. 通过在先前出版物^26,27 中描述的传统脂肪收集技术中进行标准吸脂来收获脂肪组织。确保使用由普通乳酸林格氏液和肾上腺素以 1：200,000 的比例组成的膨胀溶液。
2. 在负压和振动下，用 4 毫米的抽吸套管将吸脂到无菌袋中。立即将收获的脂肪转移到实验室。

2. mSVF 隔离

1. 在细胞培养通风橱中执行以下步骤（第 2 部分和第 3 部分），以提供无菌工作区。穿上普通的实验服和手套，以确保生物安全等级为 2。
2. 准备培养基：在 500 mL 高葡萄糖 Dulbecco 改良 Eagles 培养基 （DMEM） 中补充 50 mL 胎牛血清 （FBS）、5 mL 青霉素-链霉素。
3. 将吸脂液转移到 50 mL 离心管中。
4. 将脂肪抽吸物转移到无菌 20 mL 鲁尔锁注射器中，并连接 ....

讨论

SVF 的机械分离为传统的酶法方法提供了一种优雅的替代方案，并为临床应用提供了广泛的途径²⁹。事实上，正如本手稿中提出的，mSVF 已经在临床上用于疤痕的软组织治疗或作为整容手术的辅助手段³⁰。这里介绍的方案提供了一种有效的局部递送活 mSVF 细胞的简单方法。虽然仅使用 mSVF 细胞的阳性对照在 7 天后显示出吸收值下降的趋势?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-Wellplate	Sarstedt	83.3921
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Biochemica	A1001.0010
50 mL-Falcon	Falcon	352070
Absorbent Towels, Two Pack	Halyard	89701
Alamar blue 25 mL	Invitrogen	DAL1025
Albumin, Bovine (BSA)	VWR	0332-500G
Biotek Cytation 5	Agilent		Cell Imaging Multimode Microplate Reader
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670-500G
Cryostat	Microtome
DMEM with 4,5 g/L glucose,with L-Glutamine, with sodium pyruvate	VWR	392-0416
DPBS	Gibco	14190-144
Epinephrin	Sigma-Aldrich	E4250
Fetal Bovine Serum	Biowest	S181H-500
Fibrinogen Human Plasma 100 mg	Sigma-Aldrich	341576-100MG
Formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Formalin 4%	Formafix	1308069
FSC 22-Einbettmedium, blau	Biosystems	3801481S
Hematoxylin & Eosin Solution	Sigma-Aldrich	H3136 / HT110132
Lactated Ringer’s Solution 1000 mL	B Braun	R5410-01
Mercedes Cannula 4mm	MicroAire	PAL-R404LL
NaCl 0.9%	Bbraun	570160
OCT Embedding Matrix 125 mL	CellPath	KMA-0100-00A
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	10342243
PBS 1%	Sigma-Aldrich	P4474
PenStrep	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Petridish 150mm	Sarstedt	83.1803
Phalloidin-iFluor 488 Reagent	Abcam	ab176753
Sterile Syringe 20 mL Luer	HENKE-JECT	5200-000V0
Sterile Syringe 30 mL Luer-Lock	BD	10521
Thrombin from Human Plasma	Sigma-Aldrich	T6884-100UN
Tranexamic acid	Orpha Swiss	6837093
Tulipfilter 1.2	Lencion Surgical	ATLLLL
Tulipfilter 1.4	Lencion Surgical	ATLLLL