蛛网膜下腔出血后脑切片中重要和非重要脑周细胞的成像

摘要

初步调查证实，蛛网膜下腔出血 （SAH） 会导致脑周细胞死亡。评估 SAH 后周细胞收缩力需要区分活的和无活的脑周细胞。因此，已经开发了一种在脑切片中同时标记活和无活脑周细胞的程序，便于使用高分辨率共聚焦显微镜进行观察。

摘要

周细胞是位于大脑微循环内的关键壁细胞，在通过收缩力调节主动调节脑血流方面发挥着关键作用。传统上，它们的收缩力是通过观察特定情况下的形态变化和附近的毛细管直径变化来衡量的。然而，组织固定后、评估活力和随之而来的成像脑周周细胞的周细胞收缩力会受到影响。同样，对脑周细胞进行基因标记在区分活细胞和非活周细胞方面存在不足，特别是在蛛网膜下腔出血（SAH）等神经系统疾病中，我们的初步研究证实了脑周细胞的死亡。已经设计了一种可靠的方案来克服这些限制，能够在脑切片中同时对功能性和非功能性脑周细胞进行荧光标记。这种标记方法允许高分辨率共聚焦显微镜可视化，同时标记脑切片微血管系统。这种创新方案提供了一种评估脑周细胞收缩性、其对毛细血管直径和周细胞结构的影响的方法。在 SAH 背景下研究脑周细胞收缩力可以深入了解其对脑微循环的影响。

引言

脑周细胞以其细长的突起和突出的细胞体为特征，环绕着微循环 ^1,2。虽然脑血流增加主要由毛细血管扩张驱动，但较小的动脉表现出较慢的扩张速度³。周细胞收缩力对毛细血管直径和周细胞形态产生影响，影响血管动力学⁴.脑周细胞的收缩导致毛细血管收缩，在病理情况下，过度收缩可能会阻碍红细胞流动⁵.多种因素，包括从蓝斑释放的去甲肾上腺素，可诱导毛细血管内的脑周细胞收缩⁶.周细胞在脑血流中起调节作用，表现出 20-HETE 合成，在高氧期间充当氧传感器⁷。氧化-硝化应激引发的脑周细胞收缩对毛细血管产生不利影响⁵.尽管对脑周细胞收缩进行了体内和体外研究⁸，但关于脑切片中活和非活脑周细胞成像的知识仍然有限。

至关重要的是，脑周细胞的组织固定后成像会影响其活力和随后的收缩性评估。此外，在神经系统疾病（例如蛛网膜下腔出血 - SAH）等情况下，脑周细胞的转基因标记无法区分活的和无活的周细胞，正如我们初步的 SAH 诱导的....

研究方案

该实验方案已获得昆明医科大学动物伦理与使用委员会（kmmu20220945）的批准。本研究使用Sprague-Dawley（SD）两性大鼠，300-350g。

1. 诱导SAH模型

1. 使用2%异氟烷和100%氧气麻醉大鼠。通过提供异氟烷（1%-3%）的连续吸入麻醉来维持麻醉。使用立体定位装置固定大鼠的头部（参见 材料表）。
2. 按照以下步骤创建 SAH 模型。
   1. 将显微注射针插入鞍上蓄水池。然后，使用注射泵将来自大鼠尾动脉（不含抗凝剂）的自体血液注入鞍上池（参见 材料表）。
   2. 使用上述坐标将显微注射针植入右侧脑室：前囟，-0.8 mm;横向，1.4毫米;深度，4 mm⁹。对于 SAH 组，注射 0.2 mL 大鼠尾动脉血。对于假组，施用相同体积的等渗盐水（图1A）。

2. 脑切片的制备和稳定

1. 使用2%异氟烷吸入深度麻醉大鼠。斩首后，取出整个大脑并将它们浸入冰冷的人工脑脊液 （ACSF） 中。
   注：使用具有以下成分的新鲜制备的 ACSF 溶液：134 mM ....

讨论

开发的是高分辨率共聚焦成像技术，用于可视化重要的脑周细胞、非重要的脑周细胞和脑切片中的微血管系统。在急性大鼠脑切片中，该过程需要用 TO-PRO-3¹¹ 初始标记周细胞，然后用 IB4¹² 标记微血管内皮细胞;随后，使用PI进行死亡周细胞的鉴定。该协议简单明了，可重复，并且高度适用于功能研究。

为了特异性地追踪神经系统内的脑周细?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	ABC biochemistry	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
Aluminium foil	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
Confocal imaging software	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
Confocal Laser Scanning Microscope	Nikon	N-SIM/C2si	RT
Gas tank (5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
Glass Bottom Confocal Dishes	Beyotime	FCFC020-10pcs	RT
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	RT
Glue	EVOBOND	KH-502	RT
Ice machine	XUEKE	IMS-20	RT
Image analysis software	National Institutes of Health	Image J	RT
Inhalation anesthesia system	SCIENCE	QAF700	RT
Isolectin B 4-FITC	SIGMA	L2895–2MG	Store aliquots at –20 °C
KCl	Sigma-Aldrich	7447–40–7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647–14–5	RT
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	10049–21–5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318314	RT
Peristaltic Pump	Scientific Industries Inc	Model 203	RT
Propidium (Iodide)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	Store aliquots at –20 °C
Stereotaxic apparatus	SCIENCE	QA	RT
Syringe pump	Harvard PUMP	PUMP 11 ELITE Nanomite	RT
Thermostatic water bath	OLABO	HH-2	RT
Vibrating microtome	Leica	VT1200	RT