从成年小鼠脊髓中分离纯星形胶质细胞和小胶质细胞，用于 体外 测定和转录组学研究

摘要

该方案概述了从成年小鼠脊髓中分离纯化的星形胶质细胞和小胶质细胞，促进了后续应用，如RNA分析和细胞培养。它包括详细的细胞解离方法和程序，旨在提高分离细胞的质量和产量。

摘要

星形胶质细胞和小胶质细胞在中枢神经系统发育、损伤反应和神经退行性疾病中起着关键作用。这些高度动态的细胞表现出对环境变化的快速反应，并在形态、转录谱和功能方面表现出显着的异质性。虽然我们对神经胶质细胞在健康和疾病中的功能的理解已经有了很大的进步，但仍然需要在损伤或损伤的背景下进行 体外细胞特异性分析，以全面表征不同的细胞群。与细胞系或新生动物相比，从成年小鼠中分离细胞具有多项优势，因为它允许在病理条件下和特定时间点分析细胞。此外，专注于脊髓特异性分离（不包括脑部受累）可以研究脊髓病理学，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎、脊髓损伤和肌萎缩侧索硬化症。该方案提供了一种从成年小鼠脊髓中分离星形胶质细胞和小胶质细胞的有效方法，有助于立即或将来的分析，并在功能，分子或蛋白质组学下游研究中具有潜在应用。

引言

星形胶质细胞和小胶质细胞是多功能神经胶质细胞，在中枢神经系统 （CNS） 中起着至关重要的作用，包括调节神经元功能、促进中枢神经系统发育、维持血脑屏障以及参与其他关键过程^{等职责 1,2,3,4}.除了在维持体内平衡方面的作用外，这些神经胶质细胞在损伤和修复机制中也起着关键作用。小胶质细胞以其吞噬、炎症和损伤后的迁移能力而闻名 ^5,6,7。疾病中的星形胶质细胞反应同样多种多样，包括炎症、神经胶质瘢痕的形成和血脑屏障的损害 ^8,9。尽管我们对小胶质细胞和星形胶质细胞在中枢神经系统中的有害和修复作用的理解有所增长，但它们的结构和功能固有的异质性需要强大的工具来研究它们在各种情况下。

进一步了解小胶质细胞和星形胶质细胞在健康和疾病中的作用需要 体内 和 体外 研究的综合方法。 体内

研究方案

所有动物护理和实验程序均在乔治华盛顿大学医学与健康科学学院（美国华盛顿特区;IACUC#2021-004）。该研究利用了10周至5个月的雄性和雌性C57BL / 6J野生型（WT）小鼠，这些小鼠来自商业供应商（见 材料表）并安置在乔治华盛顿大学。协议工作流程的概述如 图 1 所示。

1.脊髓的准备

1. 使用Avertin（12.5mg / mL的2,2,2-三溴乙醇和2.5%2-甲基-2-丁醇在无菌水中）麻醉动物（见 材料表）。确认小鼠对脚趾和尾巴捏合没有反应。
2. 用冷 1x Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 进行心脏灌注，以去除外周血单核细胞。
   1. 将动物放在浅托盘上，并做一个侧切口以暴露胸膜腔。将连接到蠕动泵的 23 G 灌注针（参见 材料表）插入左心室并激活泵。一旦冷 DPBS 流经心脏，在右心房创建一个小切口。
      注意：在此步骤中首选更快的灌注速率以增强细胞活力。血液应在 1 分钟内冲洗干净。清除肝脏提示灌注成功。
3. 用大剪刀将动物斩首并移除脊柱¹⁴.将其浸没在含有 Ca²⁺/Mg²⁺

讨论

分离纯活的原代细胞对于研究特定细胞类型的结构和功能至关重要。在成年小鼠中，特别是在脊髓中，这项任务带来了重大挑战，因为现有的方案通常不是针对成年脊髓量身定制^的10,17。该方案提供了一种高效且具有成本效益的方法，适用于各种下游应用，包括细胞培养、流式细胞术、组织学和转录组学研究。

脊髓制备的速度在确?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Aldrich	T48402
24 well tissue culture plate	Avantor	10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%	Thermo Fisher	A18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride	Invitrogen	D1306	1:1000
45% glucose solution	Corning	25-037-CI
5 mL capped tubes	Eppendorf	30122305
Acetic acid	Sigma-Adlrich	A6283
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead Kit	Miltenyi	130-097-679
Anti-Iba1	Wako	019-1974
Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice	Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeads	Miltenyi	130-093-634
Celltrics 30 µm filter	Sysmex Partec	04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer)	Hausser Scientific Co	3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	D4527-40KU
Distilled water	TMO	15230001
DMEM/F12	Thermo Fisher	11320074
DNase for RNA purification	Qiagen	79254
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Thermo Fisher	14040117
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	A5209401
GFAP antibody (mouse)	Santa Cruz	sc-33673	1:500
GFAP antibody (rabbit)	Dako	Z0334	1:500
Goat anti-mouse 594 IgG	Invitrogen	a11032	1:500
Goat anti-mouse 594 IgM	Invitrogen	a21044	1:300
Goat anti-Rabbit 488 IgG	Invitrogen	a11008	1:500
Iba1 antibody (rabbit)	Wako	019-1974	1:500
MACS Separator	Miltenyi	130-042-303
Masterflex C/L Pump System	Thermo Fisher	77122-22
MEM	Corning	15-015-CV
Methanol	Sigma-Adlrich	439193
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10
MS Columns	Miltenyi	130-042-401
O4 Antibody	R&D	MAB1326
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Plugged 9" glass pasteur pipette	VWR	14672-412
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10	Fisher scientific	22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm	Kawasumi	D3K2-23G