优化小鼠原晶状体上皮细胞培养：胰蛋白酶消化综合指南

摘要

本手稿概述了用于培养原晶状体上皮细胞 （LEC） 的详细视频方案，旨在提高可重复性并帮助白内障和后囊混浊 （PCO） 的研究。它提供了有关晶状体解剖、LEC 分离和验证的分步说明，可作为有价值的指南，尤其是对于该领域的新手而言。

摘要

晶状体上皮细胞（LECs）在维持晶状体的稳态和正常功能方面发挥着多种重要作用。LEC 决定了晶状体的生长、发育、尺寸和透明度。相反，功能失调的 LEC 可导致白内障形成和后囊混浊 （PCO）。因此，建立强大的原代LEC培养系统对于从事晶状体开发、生物化学、白内障治疗和PCO预防的研究人员非常重要。然而，由于原代LECs的可用性有限、增殖速度慢且性质脆弱，其培育长期以来一直面临挑战。

本研究通过提出原代 LEC 培养的综合方案来解决这些障碍。该方案包含基本步骤，例如配制优化的培养基、晶状体胶囊的精确分离、胰蛋白酶消化技术、传代培养程序、收获方案以及储存和运输指南。在整个培养过程中，使用相差显微镜监测细胞形态。

为了确认培养的LEC的真实性，进行了免疫荧光测定以检测关键晶状体蛋白（即αA和γ晶状体蛋白）的存在和亚细胞分布。这一详细的方案为研究人员提供了培养和表征原发性 LEC 的宝贵资源，从而促进了我们对晶状体生物学的理解和晶状体相关疾病治疗策略的开发。

引言

眼睛的晶状体通过将入射光聚焦到视网膜上，在视觉中起着至关重要的作用。它由透明的无血管结构组成，由特化细胞组成，其中晶状体上皮细胞 （LEC） 是关键参与者。LEC 位于晶状体的前表面，负责保持其透明度、调节水平衡并参与晶状体生长和发育 ^1,2。LEC 是位于晶状体前部的一种独特类型的细胞，通过在整个生命周期中持续产生晶状体纤维，在维持晶状体清晰度和功能方面发挥着关键作用。

白内障的特征是晶状体逐渐混浊，导致光线失真和散射，导致视力受损 ^3,4。白内障形成的确切机制是复杂和多因素的，涉及各种细胞和分子过程，如紫外线辐射、氧化损伤和糖基化 ^5,6。已发现 LEC 对白内障的发展有显着贡献，使其成为研究的重要焦点 1,2,7,8,9。

此外，当今眼科最紧迫的问题之一是后囊混浊 （PCO） 的发生率相对较高，也称为继发性白内障。PCO 仍然是白内障手术后最常见的并发症，在手术后 5 年内影响多达 20-40% 的成人患者和 100% 的儿童¹⁰.PCO主要是由白内障摘除术后残留在囊袋中的LEC引起的。这些细胞经历多方面的病理生理学转化，不仅涉及上皮-间充质转化 （EMT），还涉及 LEC 向晶状体纤维的分化，从而形成 LEC、纤维和肌成纤维细胞的混合物细胞群 11,12,13。转化的细胞增殖并迁移到晶状体后囊，导致视力障碍。了解培养模型中 LEC 的行为和控制机制可以为 PCO 的预防和管理提供有价值的见解。因此，这种培养 LEC 的方案为眼科研究人员提供了一个重要的工具，旨在研究、理解并最终对抗这种普遍的术后并发症。

为了揭示LEC生物学的复杂性及其在白内障形成和PCO中的作用，必须建立强大且可重复的 体外 原代细胞培养系统。原代 LEC 培养为研究人员提供了一个受控环境来研究 LEC 的功能、信号传导和分子特征。此外，它还允许研究细胞过程和不同实验条件的影响，为晶状体生理学和病理学提供有价值的见解。

先前的研究丰富了我们对LEC培养技术的理解^{14,15,16,17,18,19,20}。尽管这些研究采用了各种方法，并在LEC行为和特征方面取得了重要发现，但目前的文献中缺乏用于培养LEC的全面且可访问的视频记录方案。这种局限性会阻碍新手研究人员准确重现技术的能力，并可能导致实验结果的不一致和变化。通过提供视频录制协议，本文旨在弥合这一差距，并提供一种标准化资源，以提高LEC文化领域的可重复性并促进知识转移。

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研究方案

所有动物实验均按照视觉和眼科研究协会关于在眼科和视觉研究中使用动物的指南进行。程序批准由北德克萨斯大学健康科学中心动物护理和使用委员会（协议编号：IACUC-2022-0008）授予。这些研究使用了通常低于2周龄的年轻C57BL / 6J小鼠。

1.培养基制备及晶状体解剖

1. 通过向 450 mL DMEM 中加入 50 mL 胎牛血清 （FBS） 和 0.1 mL 50 mg/mL 庆大霉素来制备培养基。
2. 人道地对小于2周的C57BL / 6J小鼠实施安乐死。
   注意：我们使用 CO₂ 吸入法实施安乐死。CO₂ 安乐死系统的最佳流速应位移 30% 至 70% 的腔室或笼容积/分钟。
3. 用手术剪刀轻轻取下眼睑，并用弯曲的镊子在眼窝的两侧轻轻按压，使眼睛向外突出。使用白内障刀在角膜上仔细切开，然后用弯曲的镊子小心地取出晶状体，确保不会损坏晶状体或其囊。
   注意： 执行这些步骤时要小心，以保持镜头囊的完整性。由于镜片的脆弱性，使用带有弯曲和钝头的解剖工具非常重要，以最大限度地降低镜片损坏的风险。
4. 使用带有钝头的弯曲镊子将镜片转移到 60 mm 塑料组织培养皿中，该培养皿中装满了 5 mL 预热和无菌的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 溶液，其中含有 10 μg/mL 庆大霉素。
5. 用含有 10 μg/mL 庆大霉素的 DPBS 溶液轻轻冲洗镜片，以去除任何潜在的碎屑或污染物，为进一步处理镜片做好准备，并保持无菌培养环境。
6. 为了获得足够数量的 LEC，将 4 个透镜用于 24 孔培养板，将 6 个透镜用于 6 孔培养板。

2. LECs隔离

1. 完成漂洗过程后，将镜头放在一张滤纸上，让它干燥。
2. 镜片充分干燥后，小心地将其转移到培养皿的盖子上，为取出镜片胶囊做准备。
3. 向上旋转晶状体，确保前节朝上。在使用镊子夹住前囊的同时，使用惯用手的囊镊子在囊中产生一个小撕裂。向相反方向轻轻拉动两个工具以取出胶囊并将其放入 DPBS 中，直到完成所有晶状体解剖。
   注意：为避免任何差异，研究人员应立即解剖每个晶状体上皮囊并将它们暂时储存在 DPBS 中。只有在完成所有解剖后，胶囊才能集体转移到保持在37°C的胰蛋白酶中，确保同步和均匀的暴露。
4. 小心地将镜头囊转移到 6 孔板上。向每个孔中加入 1 mL 0.05% 胰蛋白酶溶液以启动酶解过程。
5. 轻轻搅拌胰蛋白酶溶液以确保均匀渗透。将板置于细胞培养箱中，让胶囊在37°C下消化8-10分钟。
   注意：此步骤有助于晶状体囊组织的分解和随后单个上皮细胞的释放。
6. 孵育后，使用解剖剪刀小心地切碎消化的晶状体胶囊，以分解任何残留的组织团块并促进细胞分离。
   注意：强调组织切碎的彻底性，以确保从消化的晶状体胶囊中有效释放细胞。
7. 加入 0.5 mL 含有 10% FBS 的培养基以淬灭胰蛋白酶。将组织样品转移到离心管中，并以1,000× g 离心5分钟。
8. 小心地除去上清液，不要干扰细胞沉淀。使用 1 mL 培养基重悬细胞并将细胞接种在 24 孔板中。
9. 每 2-3 天更换一次培养基。

3. LECs亚文化

1. 一旦细胞达到汇合，从培养皿中取出培养基。继续用 1 mL DPBS 洗涤细胞 2 次。
2. 加入 200 μL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，将细胞置于培养箱中 5 分钟。
3. 孵育后，将细胞从培养箱中取出并在显微镜下检查它们，以确认它们已从培养皿中分离并开始漂浮。
4. 加入 1 mL 培养基，轻轻移液细胞 3-5 倍以分离所有细胞。
5. 将细胞转移到离心管中，并以1,000× g 离心5分钟。
6. 小心地除去上清液并将细胞重悬于完整的生长培养基中。
7. 如果需要，使用血细胞计数器计数细胞数量。
8. 以 1：2 或 1：3 的比例细分细胞悬液以进行传代培养。
9. 当培养物再次汇合时，重复上述过程。
   注意：LEC在高密度培养条件下茁壮成长。避免过度稀释细胞，因为这可能会阻碍它们的生长。

4.储存和运输

注意：理想的存储单元数是 ~1 × 10⁶。

1. 用 1 mL DPBS 彻底洗涤细胞 3 次。洗涤后，加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，并将细胞置于培养箱中 5 分钟。
2. 加入 2 mL 完全培养基，将细胞悬液转移到离心管中，并以 1,000 × g 离心 5 分钟。
3. 弃去上清液并将细胞重悬于由 90% FBS 和 10% DMSO 组成的冷冻培养基中，目标是细胞密度为 1 ×^{10 6} 个细胞/mL。将细胞悬液转移到冷冻管中。
4. 立即将细胞移至-20°C环境中1小时，然后在-80°C下过夜，然后永久储存在液氮中。
   注意：如果没有液氮，则可以在-80°C下初始一小时后将细胞储存在-20°C。
5. 如果需要发货，请将冷冻管中的细胞装在装有干冰的包装中，以便隔夜交付。
6. 收到细胞后，确保快速回收并将细胞置于传代培养中。如果立即培养不可行，则将细胞转移到液氮中进行长时间储存。
   注意： 如果要运送细胞，请确保样品深埋在干冰中，以防止温度波动造成潜在损坏。

5. LEC验证

1. 将LEC板入带有盖玻璃的35mm培养皿中，并培养约48小时。
2. 用PBS洗涤细胞2次，并在-20°C下用冷甲醇固定细胞10分钟。
3. 用PBS洗涤固定细胞3×5分钟，并在室温下用封闭缓冲液孵育固定细胞1小时，以防止非特异性结合。
4. 封闭后，将细胞在4°C下与一抗（αA-晶状体蛋白，γ-晶状体蛋白和PROX1抗体）在稀释缓冲液中以1：50的比例单独稀释。
5. 用PBS洗涤细胞3×5分钟，并将二抗在稀释缓冲液中以1：100稀释的二抗孵育1小时。
6. 用PBS洗涤细胞3×5分钟，并在室温下用PBS中的5μg/ mLHoechst 33342染色细胞10分钟以观察细胞核。
7. 用PBS洗涤细胞2×5分钟以除去多余的染色溶液，并使用荧光显微镜捕获细胞的荧光图像，使用DAPI通道用于细胞核，FITC通道用于αA-，γ-晶状体蛋白和PROX1。

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结果

如 图2所示，通过遵循该方案，来自C57BL / 6J小鼠的原代LEC在4小时内粘附在培养皿上。值得注意的是，有其他组织的可见残留物，例如后囊和晶状体纤维细胞的部分。然而，这些意想不到的元素并没有附着在培养皿上，因此可以通过改变培养基来去除。随后，在第三天和第五天之间，LEC开始了其扩散阶段。然后，在第七天和第十天之间可以观察到快速增长，这是对数增殖阶段...

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讨论

本文介绍的方案为成功分离、培养和传代 LEC 提供了全面的分步指南，并附有视频文档。详细的视觉指南和书面说明增强了协议的清晰度和可访问性，促进了该领域研究人员的使用和可重复性。最终目的是促进围绕 LEC 在白内障形成和 PCO（白内障手术后普遍存在的并发症）中的作用的知识体系的扩展。

当将原代 LEC 与晶状体上皮细胞系（如 HLE-B3 和 SRA01/04）进行比较时，每种?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	#25300054	For LECs dissociation
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody	Jackson ImmunoResearch	#715-545-150	For cell validation
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-605-003	For cell validation
Antibody dilution buffer	Licor	#927-60001	For cell validation
Beaver safety knife	Beaver-Visitec International	#3782235	For lens dissection
Blocking buffer	Licor	#927-60001	For cell validation
Capsulorhexis forceps	Titan Medical Instruments	TMF-124	For lens capsule isolation
DMEM	Sigma Aldrich	D6429	For LECs culture medium
DMSO	Sigma Aldrich	#D2650	For making freezing medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	#J67802	For lens dissection
Dumont tweezers	Roboz Surgical Instrument	RS-4976	For lens capsule isolation
EpiCGS-a (optional)	ScienCell	4182	For LECs culture medium
FBS	Sigma Aldrich	F2442	For LECs culture medium
Gentamicin (50 mg/mL)	Sigma-Aldrich	G1397	For LECs culture medium
Hoechst 33342 solution	Thermo Fisher	#62249	For cell validation
Micro-dissecting scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5983	For lens dissection
Micro-dissecting tweezers	Roboz Surgical Instrument	RS5137	For lens dissection
PROX1 antibody	Thermo Fisher	11067-2-AP	For cell validation
Vannas micro-dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5608	For lens capsule isolation
αA-crystallin antibody	Santa Cruz	sc-28306	For cell validation
γ-crystallin antibody	Santa Cruz	sc-365256	For cell validation