体外血脑屏障重建，模拟和治疗神经系统疾病

摘要

血脑屏障（BBB）在维持稳定和健康的大脑环境方面起着至关重要的作用。血脑屏障功能障碍与许多神经系统疾病有关。我们开发了一种 3D 干细胞衍生的 BBB 模型，用于研究脑血管病理学、BBB 完整性以及 BBB 如何被遗传和疾病改变。

摘要

血脑屏障 （BBB） 是中枢神经系统 （CNS） 的关键生理组成部分，可维持营养、清除废物并保护大脑免受病原体的侵害。血脑屏障固有的屏障特性对治疗药物递送至中枢神经系统以治疗神经系统疾病提出了挑战。血脑屏障功能受损与神经系统疾病有关。脑淀粉样血管病 （CAA） 是淀粉样蛋白在脑血管系统中的沉积导致 BBB 受损，是大多数阿尔茨海默病 （AD） 病例的合并症，表明 BBB 功能障碍或分解可能与神经退行性变有关。由于对人体血脑屏障组织的访问有限，导致正常血脑屏障功能和血脑屏障变性的机制仍然未知。为了解决这些局限性，我们通过将内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞掺入 3D 基质中，开发了一种人类多能干细胞衍生的 BBB （iBBB）。iBBB 自组装以概括 BBB 中存在的解剖结构和细胞相互作用。用淀粉样蛋白接种 iBBB 可捕获 CAA 的关键方面。此外，iBBB提供了一个灵活的平台来调节与脑血管疾病和神经退行性变有关的遗传和环境因素，以研究遗传和生活方式如何影响疾病风险。最后，iBBB可用于药物筛选和药物化学研究，以优化向中枢神经系统的治疗输送。在该方案中，我们描述了由人类多能干细胞产生的三种细胞（内皮细胞，周细胞和星形胶质细胞）的分化，如何将分化的细胞组装到iBBB中，以及如何使用外源性淀粉样蛋白 在体外 模拟CAA。该模型克服了使用具有生物学保真度和实验灵活性的系统研究活体人脑组织的挑战，并能够研究人类血脑屏障及其在神经退行性变中的作用。

引言

血脑屏障 （BBB） 是将中枢神经系统 （CNS） 与外周分开的关键微血管网络，以维持正常神经元功能的理想环境。它通过维持代谢稳态 1,2,3,4、清除废物 ^4,5,6 以及保护大脑免受病原体和毒素的侵害，在调节物质流入和流入中枢神经系统方面起着关键作用 ^7,8。

血脑屏障的主要细胞类型是内皮细胞（EC）。源自中胚层谱系的内皮细胞形成脉管系统的壁 ^1,9。微血管 EC 彼此形成紧密连接，大大降低其膜的通透性^10、11、12....

研究方案

1. 将 iPSC 分化为 iBBB 细胞

注：这些分化方案先前已在Mesentier-Louro等人³⁴中描述过。

1. 包被细胞培养板
   1. 在4°C下解冻还原生长因子（GF）膜基质过夜。 在 49.5 mL DMEM 中稀释 500 μL 基底膜基质。保持该溶液低温，以防止涂层溶液过早聚合。
   2. 每孔加入 1-2 mL 的 6 孔组织培养处理板。在用适当的加热培养基替换之前，将包衣溶液在37°C下保持至少20分钟。
2. 人 iPSC 分化为 ETV2 诱导的内皮细胞
   时间：8天
   注意：该协议改编自Blanchard等人²⁴ 和Qian等人³⁵。我们使用转录因子 ETV2 的多西环素诱导表达，如 Wang 等人 ³⁶ 所述来提高产量。通过 PiggyBac 质粒引入 ETV2，然后转染细胞。
   1. 在无饲养层的多能干细胞培养基中，在还原的GF基底膜基质包被板上培养iPSC，直到细胞达到~70%的汇合度。
      注意：我们建议通过选择PiggyBac质粒（即嘌呤霉素）来维持诱导型iPSC
   2. 第0天： ....

讨论

血脑屏障功能障碍是许多神经系统疾病的合并症，并且可能是原因或加重因素^7,40,41。然而，几乎不可能研究人类神经血管疾病患者血脑屏障功能障碍和分解的分子和细胞生物学。本方案中介绍的诱导型BBB（iBBB）提供了一个体外系统，该系统概括了BBB的重要细胞相互作用，包括血管管的形成和星形胶质细胞端足与脉管系?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6e10 amyloid-β antibody	Biolegend	SIG-39320	Used at 1:1000
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Activin A	Peprotech	20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies	Invitrogen	Various	Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril	AnaSpec	AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril	AnaSpec	AS-20276
Aquaporin-4 antibody	Invitrogen	PA5-53234	Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements	ScienCell	1801
B-27 serum-free supplement	Gibco	17504044
BMP4	Peprotech	120-05ET
CHIR99021	Cyamn Chemical	13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium	Gibco	10565018
Doxycycline	Millipore-Sigma	D3072-1ML
FGF-basic	Peprotech	100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium	VWR	100502-406
Forskolin	R&D Systems	1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement	Gibco	A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes	Mattek Corporation	P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement	Gibco	35050061
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Human Endothelial Serum-free medium	Gibco	11111044
LDN193189	Tocris	6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)	Gibco	11140050
N-2 supplement	Gibco	17502048
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Normal Donkey Serum	Millipore-Sigma	S30-100mL	Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher	28908
PDGF-BB	Peprotech	100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody	R&D Systems	AF385	Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Gibco	10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody	R&D Systems	AF806	Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)	AddGene	Catalog #168805
S100B antibody	Sigma-Aldrich	S2532-100uL	Used at 1:500
SB43152	Reprocell	04-0010
Thioflavin T	Chem Impex	22870	Used at 25uM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody	R&D systems	AF938	Used at 1:500
VEGF-A	Peprotech	100-20
Y27632	R&D Systems	1254/10
ZO-1	Invitrogen	MA3-39100-A488	Dilution = 1:500