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摘要

此处介绍的方案能够通过单细胞质谱流式细胞术鉴定和对肌肉干细胞和祖细胞进行高维分析，并通过 FACS 纯化它们，以深入研究其功能。这种方法可用于研究疾病模型中的再生动力学并测试药物干预的疗效。

摘要

骨骼肌再生是由成体肌肉干细胞及其后代驱动的动态过程。成体肌肉干细胞大多处于静止状态，在肌肉受伤时被激活。激活后，它们增殖，大多数后代分化产生具有融合能力的肌肉细胞，而其余的自我更新以补充干细胞库。虽然肌肉干细胞的身份是在十多年前定义的，但基于细胞表面标志物的共表达，直到最近才使用高维单细胞方法鉴定出肌源性祖细胞。在这里，我们提出了一种单细胞质谱流式细胞术 （飞行时间流式细胞术 [CyTOF]）方法，用于分析急性肌肉损伤中的干细胞和祖细胞，以解决肌肉再生过程中展开的细胞和分子动力学。该方法基于同时检测新的细胞表面标志物和关键的肌原转录因子，其动态表达能够识别代表肌发生标志的活化干细胞和祖细胞群。重要的是，描述了一种基于检测细胞表面标志物 CD9 和 CD104 的分选策略，能够使用荧光激活细胞分选 （FACS） 前瞻性分离肌肉干细胞和祖细胞，以深入研究它们的功能。肌肉祖细胞为研究肌肉干细胞命运的控制、确定肌肉疾病的新治疗靶点以及开发再生医学的细胞治疗应用提供了一个关键的缺失环节。这里介绍的方法可用于研究 体内 肌肉干细胞和祖细胞响应扰动，例如针对特定信号通路的药物干预。它还可用于研究肌肉疾病动物模型中肌肉干细胞和祖细胞的动力学，促进我们对干细胞疾病的理解并加速疗法的开发。

引言

骨骼肌是人体质量最大的组织，调节从视力到呼吸、从姿势到运动以及新陈代谢的多种功能1。因此，保持骨骼肌的完整性和功能对健康至关重要。骨骼肌组织由紧密堆积的多核肌纤维束组成，周围环绕着复杂的神经和血管网络，表现出非凡的再生潜力 1,2。

骨骼肌再生的主要驱动力是成体肌肉干细胞 （MuSCs）。也称为卫星细胞，由于其独特的解剖位置靠近肌纤维质膜和基底层下方，它们于 1961 年首次被发现3。MuSC 表达一种独特的分子标志物，即转录因子配对盒 7 （Pax7）4。它们在健康成年人中大多处于静止状态，在肌肉受伤时被激活并增殖产生后代，这些后代将 （i） 分化为具有融合能力的肌肉细胞，这些细胞将形成新的肌纤维以修复肌肉损伤或 （ii） 自我更新以补充干细胞库5。

在细胞和分子水平上，再生过程是相当动态的，涉及细胞状态转换，其特征是关键肌原转录因子的协调表达，也称为肌原调节因子 （MRF）6,7。先前的体内发育研究、谱系追踪实验和使用成肌细胞的细胞培养工作表明，这些转录因子的顺序表达驱动肌生成，生肌因子 5 （Myf5） 在激活时表达，生肌分化 1 （MyoD1） 表达标记对生肌程序的承诺，肌生成素 （MyoG） 表达标记分化 8,9,10,11， 12,13,14。尽管有这些知识并且发现了纯化 MuSCs 的细胞表面标志物，但一直缺乏沿肌原分化途径识别和分离离散种群并解决体内肌原进展的策略和工具 15,16,17,18。

在这里，我们提出了一种基于最近发表的研究的新方法，该方法能够识别骨骼肌中的干细胞和祖细胞，并分析它们在急性肌肉损伤背景下的细胞、分子和增殖动力学19。这种方法依赖于单细胞质谱流式细胞术（也称为飞行时间流式细胞术 [CyTOF]）来同时检测关键细胞表面标志物（α7 整合素、CD9、CD44、CD98 和 CD104）、细胞内肌原转录因子（Pax7、Myf5、MyoD 和 MyoG）和核苷类似物（5-碘-2′-脱氧尿嘧啶，IdU），以监测 S 期细胞19,20， 21,22,23。此外，该方案提出了一种基于检测两种细胞表面标志物 CD9 和 CD104 的策略，通过荧光激活细胞分选 （FACS） 纯化这些细胞群，从而能够在未来深入研究它们在损伤和肌肉疾病背景下的功能。虽然原代成肌细胞过去被广泛用于研究体外成肌分化的晚期阶段，但尚不清楚它们是否概括了体内发现的肌肉祖细胞的分子状态 24、25、26、27、28、29、30.成肌细胞的产生既费力又耗时，并且这种原代培养物的分子状态在传代后迅速变化31。因此，用这种方法纯化的新鲜分离的生肌祖细胞将提供一个更生理的系统来研究肌发生和体外遗传或药理学操作的影响。

这里介绍的方案可用于解决各种研究问题，例如，研究肌肉疾病动物模型中体内肌源区室的动力学，以响应急性遗传操作或药物干预，从而加深我们对不同生物学背景下肌肉干细胞功能障碍的理解，并促进新型治疗干预的开发。

研究方案

动物程序已获得丹麦动物实验检查局（协议 # 2022-15-0201-01293）的批准，实验按照奥胡斯大学的机构指南进行。在受伤前 24 小时在饮用水中提供镇痛剂（丁丙诺啡），以使小鼠适应味道。受伤后持续在饮用水中供应丁丙诺啡 24 小时。在急性肌肉损伤时皮下 （s.c.） 注射丁丙诺啡，注音欣注射后饮用水中的丁丙诺啡将减轻与损伤相关的疼痛。虽然建议在急性肌肉损伤时皮下注射丁丙诺啡，然后在饮用水中注射丁丙诺啡，但在受伤前在饮用水中注射丁丙诺啡是可选的。但是，研究人员必须遵守相关监管机构制定的动物福利标准和指南。

注意：对于受伤后肢肌肉的单细胞质谱流式细胞术 （CyTOF） 实验，从第 1 部分开始：肌肉损伤前 24 小时至受伤后 24 小时在水中镇痛。为了从未受伤小鼠中分选肌肉干细胞和祖细胞，执行第 5 节和第 6 节：安乐死 + 骨骼肌解剖和解离，并继续进行第 11 节：用荧光团偶联抗体对 FACS 进行染色。 实验装置和协议的概述如图 1 所示。

1. 肌肉损伤前 24 小时至受伤后 24 小时水中镇痛

  1. 向深色或铝箔包裹的饮水瓶中加入 3 mL 丁丙诺啡 （0.3 mg/mL），并用过滤水填充至 100 mL，以达到受伤前 24 小时的 0.009 mg/mL 终浓度。连接到鼠标笼。
  2. 受伤后 24 小时取下饮水瓶，并将小鼠笼重新连接到饮水阀系统。

2. 准备急性损伤手术

注意：使用 70% 乙醇对工作台、鼻锥装置和感应箱进行消毒。

  1. 用稀释的 notexin in PBS （5 μg/mL） 制备一根 1.5 mL 试管。在无菌 0.9% 盐水中稀释丁丙诺啡 （0.3 mg/mL） 至 0.015 mg/mL，装在光安全的 1.5 mL 试管中。保持在冰上。准备用于丁丙诺啡 （28 G， 0.5 mL） 和 notexin 注射 （29 G， 0.3 mL） 的胰岛素注射器。
  2. 配置基于异氟醚的麻醉装置：
    1. 对于感应箱中的麻醉，使用 3% 异氟醚，流量为 1.5 L/min（50% O 2,50% 大气）。
    2. 对于使用鼻锥设置的维护，使用 1.5% 异氟醚，流量为 0.6 L/min（50% O 2,50% 大气）。

3. notexin 注射引起的急性损伤

注意：Notexin 具有磷脂酶 A2 活性，是澳大利亚虎蛇 （Notechis scutatus） 毒液的主要成分，小鼠静脉注射 LD50 为 5-17 mg notexin/kg32,33。在本方案中，用 10 μL 5 mg/mL notexin 注射每个后肢的胫骨前肌 （TA） 肌肉，用 15 μL 5 mg/mL notexin 注射每个后肢的腓肠肌 （GA） 肌肉两次（一次进入每个头部肌肉）。正确进行肌内 （i-m.） 注射以限制损伤并经常检查注射的动物以确保将疼痛降至最低，这一点很重要。

  1. 在诱导箱中麻醉小鼠（3% 异氟醚）。当小鼠失去知觉时，将感应箱中的异氟醚水平降低至 1.5%。
  2. 根据机构批准的程序对小鼠进行称重和单独标记。在鼻锥设置下，用修剪器剃掉后肢，然后转移回感应盒。
  3. 计算每只小鼠的丁丙诺啡体积： figure-protocol-1851
  4. 通过上下移液混合 notexin 溶液。准备 2 个胰岛素注射器（29 G，0.3 mL），装有 10 μL notexin 溶液 （5 μg/mL） 用于 TA 注射，4 个胰岛素注射器装有 15 μL notexin 溶液 （5 μg/mL） 用于 GA 注射。
    注意：胫骨前肌 （TA） 位于小鼠小腿的前侧，从膝盖延伸到脚踝。腓肠肌 （GA） 是位于小腿后部、比目鱼肌浅表的双头肌肉。它从膝盖上方的两个头（内侧和外侧）延伸到脚后跟，延伸到总共三个关节（膝盖、踝关节和距下关节）。
  5. 进行肌肉注射
    1. TA 注射液（共 2 次注射）
      1. 将鼠标仰卧在鼻锥设置下，并用无菌酒精湿巾（70% 乙醇或异丙醇）对注射部位进行消毒。将针头向下斜向插入 TA 的腹部（中腹部远端）成 30° 角。沿着肌肉推进针头，平行于胫骨移动，到达 TA 的中腹部。缓慢连续地注射 notexin，将针头留在原位 10 秒后再取出。最初不要将针头插入太深（以避免将 TA 下方的 notexin 注射到趾长伸肌中），并且在推进针头时不要靠近近端（以避免注射得太靠近膝盖）。
    2. GA 注射液（共 4 次注射）
      1. 将针头向下斜切，以 ~45° 角插入 GA 侧头的中腹部。缓慢连续地注射 notexin，将针头留在原位 10 秒，然后再取出。如上所述，旋转后肢并在 GA 肌肉的内侧头注射 notexin。应注意不要将针头插入太深。
  6. 将鼠标转过来，使用胰岛素注射器 （28 G， 0.5 mL） 注射丁丙诺啡 s.c.。将鼠标转移到加热板上的空恢复笼中。只有一半的笼底应放在加热板上，以允许鼠标在恢复过程中进行体温调节34。对其余小鼠重复步骤 3.3-3.6。
  7. 当恢复笼中的鼠标完全唤醒时，将其移回原来的笼子中。将其放回马厩，并补充湿粮。注射后 24 小时取出丁丙诺啡饮水瓶。
  8. 注射 notexin 后监测小鼠 6 小时，然后每 12 小时监测 2 天是否有疼痛、活动能力受损和食物消耗减少的迹象35,36。

4. 5-碘-2'-脱氧尿嘧啶注射液

注意：5-碘-2'-脱氧尿嘧啶 （IdU） 被怀疑会导致遗传缺陷并损害生育能力或未出生的孩子。处理前请阅读安全数据表 （SDS）。处理时应穿戴个人防护装备。称量 IdU 粉末时使用通风橱。应根据当地安全法规丢弃与 IdU 接触的材料。

注： 体内 IdU 标记用于监测损伤时间过程中的细胞分裂，因为 IdU 是一种碘化胸苷类似物，可掺入 S 期细胞的 DNA 中。在处死小鼠前8小时以20mg / kg体重腹膜内（ip）注射IdU。

  1. 使用 37 °C 的超声仪在无菌 PBS 中制备 2 mg/mL 的 IdU 储备液。IdU 对光敏感;当天使用或在 -20 °C 下冷冻长达 3 个月。如果使用冷冻的 IdU：解冻、涡旋、以 10,000 x g 离心 30 秒，并使用上清液进行以下注射。
  2. 在诱导箱中麻醉小鼠（3% 异氟醚）。记下指定标记，称量小鼠，并计算 IdU 溶液的体积： figure-protocol-3537
  3. 使用胰岛素注射器（28 G，0.5 mL）进行腹腔注射，并将鼠标转移到加热板上的空恢复笼中。唤醒时，将鼠标移回其原始笼子。对剩余的小鼠重复步骤 4.2-4.3，并将它们放回稳定室。

5. 安乐死

注：缓冲液配方见 表 1 。准备洗涤培养基（营养混合物 F-10 （Ham's）、10% 马血清、1x Pen/Strep）并通过聚醚砜 （PES） 膜过滤到聚苯乙烯容器中。准备解离缓冲液（补充有 650 U/mL 胶原酶 II 型的洗涤培养基）并保持在冰上。CyTOF 质谱流式细胞术测量对污染物非常敏感。因此，必须使用最高分析级的试剂进行样品处理。为防止金属污染，强烈建议使用无菌塑料器皿和从未用清洁剂清洗过的新玻璃器皿，因为许多实验室肥皂含有高浓度的钡。建议使用双过滤蒸馏去离子水进行试剂制备。磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 在内部制备。将 10x 原液稀释至 1x 并用 0.2 μm 过滤器过滤 1x PBS。在每个实验开始时再次过滤 1x PBS。由于存在钡，不得用清洁剂清洁解剖工具。

  1. 用感应箱准备体重秤、容器和基于异氟醚的麻醉装置。对适当的解剖工具进行消毒。
  2. 为每只小鼠准备 50 mL 试管并用 5 mL 解离缓冲液和培养皿标记。将解离缓冲液保存在冰上。
  3. 在诱导箱中麻醉小鼠（3% 异氟醚，失去知觉时增加到 5%）并进行颈椎脱位。

6. 骨骼肌解剖和分离

  1. 从两个后肢解剖 TA 和 GA 肌肉，并转移到培养皿的盖子中。用剪刀将组织切成碎浆（~1 毫米3 块）。转移至含有 5 mL 冰冷解离缓冲液的 50 mL 试管中。保持在冰上。
  2. 重复安乐死程序（步骤 5.3）和骨骼肌解剖和解离程序（步骤 6.1），直到所有小鼠都处理完毕。
  3. 在 37 °C 水浴中预热所有样品管（2 分钟），并在培养箱 （37 °C） 中旋转孵育 45 分钟。
  4. 加入 10 mL 洗涤培养基涡旋和洗涤。离心（380 x g，10 分钟，室温 [RT]），并吸出至 4 mL。
  5. 添加 0.5 mL 胶原酶 （1000 U/mL） 和 0.5 mL 分散酶 （11 U/mL）。涡旋并在 37 °C 下旋转孵育 20 分钟（例如，在培养箱中）。离心（380 x g，1 分钟，RT）并用 5 mL 移液器重悬。
  6. 向 50 mL 试管中加入 40 μm 细胞过滤器，并用 5 mL 洗涤培养基预湿。使用带有 20 G 针头的 5 mL 注射器吸出并弹出细胞悬液 10 次。通过预润湿的 40 μm 细胞过滤器过滤。用 10 mL 洗涤培养基洗涤 50 mL 试管，将其转移到 40 μm 细胞过滤器中，然后离心（380 x g ，10 分钟，4 °C）细胞悬液。

7. 顺铂和多聚甲醛固定活/死染色

注意：顺铂和多聚甲醛 （PFA） 具有致癌性。处理前请阅读 SDS。多聚甲醛 （PFA;16%） 是一种皮肤、眼睛和呼吸道刺激物。穿戴个人防护装备并在通风橱下处理这些物质。在固定细胞期间，PFA 的最终浓度为 1.6%。应采取正确的保护措施，并应根据当地法规处理废物。

注意：制备冷 （4 °C） 和温 （37 °C） 无血清 DMEM。准备补充有 10% FBS 的 DMEM，通过 PES 膜过滤到聚苯乙烯容器中，并保持在冰上。制备 PBS 和细胞染色培养基 （CSM;PBS、0.5% BSA、0.02% 叠氮化钠）装在 CyTOF 专用玻璃瓶中，并通过 PES 膜过滤。CSM 可在 4 °C 下储存长达 6 个月。

  1. 吸出上清液，轻弹沉淀，然后重悬于 1 mL 无血清冷 DMEM 中。对细胞进行计数，并在无血清 DMEM 中将细胞密度调节至 1 x 106 个细胞/mL。
  2. 加入顺铂原液 （25 mM） 至终浓度为 25 μM。涡旋 10 秒并孵育 1 分钟（反应对时间非常敏感）。用冰冷的 DMEM+10% FBS（样品体积的 3 倍）淬灭反应物，并将其保存在冰上。离心（380 x g ，10 分钟，4 °C），吸出上清液并彻底重悬沉淀（在 CSM 中高达 10 x 106 个细胞/mL）。通过 35 μm 细胞过滤器过滤悬浮液。
  3. 用过滤后的 PFA 储备液 （16%） 固定细胞悬液，并上下移液（在通风橱下进行）以达到最终的 PFA 浓度 （1.6%）（例如，向 900 μL 细胞悬液中加入 100 μL 16% PFA）。涡旋 30 秒，在冰上孵育 10 分钟，然后离心用 2 mL CSM 洗涤两次（800 x g，5 分钟，RT）。
    注：此时，样品可以在干冰上快速冷冻并储存在 -80 °C 下，或直接用于抗体染色。如果要冷冻细胞，请将细胞转移到 5 mL 聚丙烯管中，因为聚苯乙烯在低温下会破裂。如果使用新鲜固定的细胞进行染色，请继续执行步骤 8.2。

8. 用金属偶联抗体染色

注意：甲醇 （MeOH） 高度易燃，对呼吸道有腐蚀性。处理前请阅读 SDS。穿戴个人防护装备并在通风橱下处理该物质。根据当地法规处理废物。

注：靶向表面标志物和细胞内标志物的抗体 （Ab） 列表见 表 2。

抗体偶联：该方案中使用的大多数抗体都是在内部偶联的，因为它们没有市售。抗体的金属偶联方案之前已经发布，偶联试剂盒现已上市37,38。G 型免疫球蛋白 （IgG） 与可用的偶联方案兼容。用于金属偶联的抗体制剂不含含半胱氨酸的载体蛋白（例如牛血清白蛋白 （BSA）），这一点非常重要，这些载体蛋白会通过竞争聚合物的游离马来酰亚胺基团来影响偶联效率，并可能干扰金属偶联抗体的定量。明胶的半胱氨酸含量远低于 BSA。但是，如果抗体制剂包含载体蛋白，建议在偶联前去除此类蛋白质。现在可以向制造商索取不含 BSA 和明胶的抗体。小分子防腐剂（例如叠氮化钠、甘油和海藻糖）与金属偶联方案兼容37,38。

抗体滴定：每次金属偶联后，应滴定抗体以确定提供最大信噪比的最佳抗体浓度。对于抗体滴定，进行 6 步 2 倍连续稀释，并对已知表达（例如肌肉细胞、阳性对照）和缺乏（阴性对照）目标蛋白 19,21,37,38 的样品进行染色。

通过将储备液稀释至 0.1 μM的 PBS/1.6% PFA 溶液，制备新鲜的 Cell-ID Intercalator-Ir（原液 = 500 μM;Intercadator-Ir 溶液）工作溶液。

  1. 在 RT 下解冻冷冻样品 5 分钟并离心（800 x g，1 分钟，RT）。用 2 mL CSM 离心洗涤（800 x g，5 分钟，RT）。
  2. 在 CSM 中制备 2.5x 表面抗体 （Ab） 染色混合物。将上清液吸出至 ~60 μL 并彻底重悬沉淀。通过添加 40 μL 表面抗体染色混合物并在 RT 下孵育 1 小时来对细胞进行染色。
  3. 每 20 分钟轻弹一次样品以混合。通过离心（800 x g，5 分钟，RT）用 1 mL CSM 洗涤两次。吸出上清液并轻弹沉淀。
    注：如果不需要细胞内染色，则不需要甲醇透化。然而，如果仅进行表面染色，则必须在含有透化剂（例如 Maxpar 固定和透化缓冲液）的缓冲液中稀释嵌入剂 - IR 溶液以穿透核膜。继续执行步骤 8.5，在含有透化剂和 1.6% PFA 的缓冲液中稀释 Cell-ID Intercalator-Ir。否则，请继续进行下面的细胞内染色。
    注意： 铱是危险的，必须采取安全处理的预防措施。铱是易燃的，对眼睛/皮肤有刺激性。避免产生和吸入灰尘或烟雾。避免接触皮肤和眼睛。然而，插层-IR 溶液混合物在水中以 <1% 的浓度提供，根据化学品分类和标签的全球统一制度 （GHS），这被认为是无害的。处理前从 Standard Biotools 读取 SDS。处理时应穿戴个人防护装备。应根据当地安全法规丢弃与插层 IR 溶液接触的材料。
  4. 要透化细胞，涡旋时滴加 0.5 mL 冰冷的 MeOH。在通风橱下的冰上孵育 15 分钟。离心（800 x g，5 分钟，RT），然后通过离心（800 x g，5 分钟，RT）用 1 mL CSM 洗涤两次。最后一次洗涤后，将上清液吸出至 ~60 μL 并彻底重悬沉淀。
  5. 在 CSM 中制备 2.5x 细胞内 Ab 染色混合物。加入 40 μL 细胞内 Ab 染色混合物并在室温下孵育 1 小时，对细胞进行染色。每 20 分钟轻弹一次样品以混合。
  6. 通过离心（800 x g，5 分钟，RT）用 1 mL CSM 洗涤两次。吸出上清液并轻弹沉淀。将样品重悬于 0.5 mL 插层铱溶液（表 1）中并涡旋。将样品在 RT 下孵育 1 小时或在 4 °C 下过夜 （O/N）（见下面的注释）。
    注意：样品可以在 4 °C 的插层铱溶液中储存长达 48 小时。本研究中使用的染色方案是根据 Nolan 实验室{C}23 的开创性工作开发的。它与标准 Biotools 方案不同，因为 （i） 使用内部制备的缓冲液进行洗涤和染色，（ii） 在表面染色前固定细胞，以及 （iii） 用甲醇透化细胞，用转录因子或信号分子抗体进行细胞内染色。开发新方案的研究人员必须彻底测试其抗体组合与甲醇作为透化剂的相容性。向检测组合添加新抗体时，建议在金属偶联和滴定之前使用阳性和阴性对照样品通过流式细胞术测试抗体特异性。

9. 上样到质谱流式细胞仪的样品制备

注：当细胞沉淀在 CAS 缓冲液中时非常松散（材料表）。在用 CAS 缓冲液洗涤期间，不要吸出至干燥。相反，请按照以下说明保留残差体积。

  1. 涡旋并离心（800 x g ，10 分钟，RT）样品。倒出上清液（作为 PFA 废物处理）并涡旋。
  2. 用 1 mL CSM 离心洗涤（800 x g，10 分钟，RT）。 吸出上清液并轻弹沉淀。
  3. 用 1 mL CAS 缓冲液离心洗涤（800 x g，10 分钟，RT）。吸出至 ~200 μL。涡旋并加入 1 mL CAS 缓冲液。取出 5 μL 等分试样进行细胞计数。离心（800 x g，10 分钟，RT）并小心吸出至 ≤50 μL。不要打扰颗粒。
  4. 在 CAS 缓冲液中将沉淀重悬至 1–2 x 106 个细胞/mL，并添加校准微珠 （1x; 材料表）至终浓度为 0.1x（例如，将 100 μL 1x 校准珠添加到 900 μL 细胞悬液中）。
  5. 将样品上样到质谱流式细胞仪中，并使用 400–500 个细胞/秒的流速收集数据。
  6. 使用 CyTOF 软件或先前开发的标准化工具对 FCS 文件进行数据标准化39。
    注意：CyTOF 质谱流式细胞仪的操作是特定于仪器的40,41。建议在操作前查阅 CyTOF 用户手册。校准微珠是金属包埋的聚苯乙烯归一化微珠标准品，含有已知浓度的金属同位素铈 （140/142Ce）、铕 （151/153Eu）、钬 （165Ho） 和镥 （175/176Lu）。校准微球可以控制机器灵敏度，机器灵敏度会随时间而变化，这主要是由于生物材料的积累和血浆电离随时间的变化。

10. CyTOF 数据分析

注：对于下游分析，标准化的 FCS 文件可以在本地分析或上传到基于云的软件解决方案，例如 Cytobank、Cell Engine、OMIQ 或 FCS Express42。

  1. 如有必要，将每个样品的单个 FCS 文件连接到一个文件中。
  2. 通过设门铱插层阳性事件来识别单细胞，从而能够区分单核细胞与碎片或双峰。
  3. 通过选择顺铂阴性事件对活细胞进行设门。顺铂与细胞蛋白共价结合，并比活细胞更大程度地标记膜受损的垂死细胞和死细胞43。
  4. 对感兴趣的群体进行门控，例如，生肌区室（Live/CD45 - / CD31 - / Sca1 - /α7整合素+ / CD9 + ）（图2A）并量化干细胞和祖细胞的相对比例。这种方法需要事先了解细胞表面或细胞内标志物表达，以定义单个群体。
  5. 为了执行高维分析，以便能够识别复杂群体中以前未识别的稀有细胞亚群，导出感兴趣的群体，并使用专为 CyTOF 数据分析开发的聚类算法44。
    注意：以前的工作采用了 X-shift 算法，该算法在高维空间中使用加权 k 最近邻密度估计 （kNN-DE） 来执行基于定义参数的无监督聚类19。X-shift 已被证明在识别稀有细胞群方面非常有效45。
  6. 对于 X 偏移分析，请下载 vortex 软件包（来自 Nolan 实验室 GitHub 页面 [https://github.com/nolanlab/vortex]）和 Java 64 位46。说明可在此处找到：https://github.com/nolanlab/vortex/wiki/Getting-Started。
  7. 将导出的细胞群上传到本地数据库并定义聚类参数。用户定义的参数包括 （i） 用于聚类的标记，（ii） k 值的范围（例如，5 到 150），以及 （iii） 聚类步骤的数量。
    注：以前的工作使用已知在肌肉干细胞中表达的表面标志物、在肌肉细胞和成肌细胞的高通量流式细胞术筛选中鉴定的新型表面标志物以及已知定义肌生成不同阶段的肌原转录因子 （TFs） 的组合作为聚类标志物。这种方法能够识别两种细胞表面标志物 CD9 和 CD104，它们的共表达模式区分了以前未识别的祖细胞群19。 仔细选择聚类标记将使研究人员能够回答特定的研究问题。例如，如果需要随时间识别和分析分裂的细胞子集，建议将 IdU 作为聚类标记之一。X-shift 可以在多个 k 值处执行聚类，并通过计算“弯头点”自动识别产生最佳聚类数的 k 值，从而避免聚类不足或过度碎片化。建议计算弯头点，并使用由最佳 k 值定义的聚类分析，用于数据可视化和下游应用程序。
  8. 为了可视化 X 移位簇内细胞群之间的空间关系，请执行力导向布局，这将生成一个 2D 图，其中簇之间的距离表明它们在高维表型空间中标记表达的相似性。通过一次使用一个标记为图谱着色，可以发现新的细胞群并跟踪它们的动态。建议通过在 Cytobank 和 Cell Engine 等软件中手动设门进行后续定量。
  9. 执行热图分析，以量化整个时间过程中多种表面和细胞内蛋白的动态表达，并揭示新趋势。
    注意：在执行受伤时间过程时，可以将所有时间点的数据聚集在一起，以生成再生图。此外，可以将这种映射剖析为各个时间点，以跟踪随着时间的推移再生的细胞和分子动力学19。

11. 用荧光团偶联抗体对 FACS 进行染色

注：用于未染色的单色对照和荧光减一 （FMO） 对照的细胞可以来自额外小鼠的 TA 和 GA 组（如果可用）。或者，可以按照与上述 TA+GA 相同的程序将股四头肌（大腿前部上部肌肉）解剖并消化成单细胞悬液，并用于对照。准备 FACS 缓冲液（PBS、2.5% 山羊血清、2 mM EDTA），通过 PES 膜过滤到聚苯乙烯容器中，并保持在冰上。FACS 缓冲液可在 4 °C 下储存长达 1 个月。用于 FACS 的抗体列表见 表 3。

  1. 准备谱系混合物。在 50 μL（包含约 3–5 x 105 个细胞）中对每个对照进行染色。计算所需的世系混合量。使体积超出 20%–30%。用于谱系混合物的抗体储备浓度为 0.2 mg/mL。
    1. 在 0.5 mL 试管中，加入抗 CD45 APC-Cy7、抗 CD31 APC-Cy7、抗 Sca1 APC-Cy7 和抗 CD11b APC-Cy7，以达到分别达到 1 μg/mL、2.5 μg/mL、2.5 μg/mL 和 0.63 μg/mL 的最终浓度。
  2. 准备全染色混合物。用 500 μL（包含约 3–5 x 106 个细胞）对每个全染色样品进行染色。制作 10% 体积过量的全染色混合物。
    1. 在 1.5 mL 试管中，添加上述谱系混合抗体 + 抗 α7 整合素 PE、抗 CD9 APC 和抗 CD104 FITC，以分别达到 2 μg/mL、1.2 μg/mL 和 3 μg/mL 的最终浓度。
  3. 制备 FACS 缓冲液 + DAPI：对于 10 mL FACS 缓冲液，添加 1 μL DAPI（原液 = 1 mg/mL）以达到 100 ng/mL 的最终 DAPI 浓度。
    注意：DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）被归类为可能的皮肤和呼吸道刺激物。然而，根据 GHS 的说法，浓度为 <1% 的 DAPI 溶液被认为是无害的。处理前请阅读 SDS。处理时应穿戴个人防护装备。应根据当地安全法规丢弃与 DAPI 接触的材料。
  4. 重悬第 6 部分的细胞：骨骼肌解剖和解离：
    1. 对于全染色样品，将单只小鼠的 TA 和 GA 组重悬于 500 μL FACS 缓冲液中，并将其转移到 15 mL 试管中进行染色。
    2. 对于控件，请使用 TA 和 GA 集或 quadricep 集。如果使用 1 只鼠标作为对照，将细胞重悬于 750 μL FACS 缓冲液中。如果多只小鼠，将每个 TA 和 GA 或股四头肌组重悬于 500 μL FACS 缓冲液中，并从每个样品中取馏分，将这些组合并为单个 1 mL 样品。将 50 μL 对照细胞（3–5 x 105 个细胞）添加到 5 mL 聚丙烯管中进行染色。
  5. 如 表 4 所述染色，在 4 °C 下在黑暗中染色 45 分钟。
  6. 通过添加 5 mL FACS 缓冲液洗涤所有染色的样品。通过加入 1 mL FACS 缓冲液并离心（380 x g ，10 分钟，4 °C）洗涤对照。
  7. 将所有染色的样品重悬于 1 mL FACS 缓冲液 + DAPI 中。将对照重悬于 300 μL FACS 缓冲液中，含或不含 DAPI。
  8. 将细胞保持在 4 °C 黑暗中，直到在带有 4 个激光器（405 nm、488 nm、561 nm、633 nm）的流式细胞仪上分选。
  9. 在分拣机上运行对照和样品，并使用相关软件创建分拣门。对于未染色/单色对照和 FMO 对照，分别记录 1 x 104 和 0.3–1 x 105 个事件。对于全染色样品，最多可记录 1 x 106 个事件。根据下游检测要求对所有全染色样品或根据需要分选。对于此处使用的流式细胞仪 （FACSAria III），使用 70 mm 喷嘴在 纯度模式下 分选。
  10. 有关门控策略，请参见 图 4 。
    1. 使用未染色和单色对照设置所有检测器的电压。
    2. 使用单色控件设置补偿矩阵。
    3. 使用 FMO 控件建立排序门。
  11. 将不同的肌肉干和祖细胞群分选到冰冷的 FACS 缓冲液中。
  12. 离心（380 x g ，10 分钟，4 °C）细胞群。在适当的缓冲液中重悬，计数并继续下游分析。

结果

在这里，我们概述了使用这种组合方法的实验设置，其中包括 （i） 通过 notexin 注射对急性损伤时间过程进行高维 CyTOF 分析，以研究骨骼肌中干细胞和祖细胞的细胞和分子动力学（图 1，上图）;（ii） 使用两种细胞表面标志物 CD9 和 CD104 对干细胞和祖细胞进行 FACS，以分离这些细胞群并对其功能进行深入研究（图 1，下图）。8...

讨论

骨骼肌再生是一个动态过程，依赖于成体干细胞的功能。虽然以前的研究集中在肌肉干细胞在再生过程中的作用，但它们在体内的后代研究不足，主要是由于缺乏识别和分离这些细胞群的工具 15,16,17,18。在这里，我们提出了一种方法，可以在骨骼肌中同时识别和...

披露声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢奥胡斯大学生物医学系 FACS 核心设施的成员提供的技术支持。我们感谢生物医学系质谱流式细胞术部门经理 Alexander Schmitz 的讨论和支持。Scientific Illustrations 是使用 Biorender.com 创建的。这项工作由奥胡斯大学 Forskningsfond （AUFF） 启动资助和诺和诺德基金会向 EP 提供的启动包资助 （0071113）。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL centrifuge tubeFisher Scientific07-200-886
20 G needleKDMKD-fine 900123
28 G, 0.5 mL insulin syringe BD329461
29 G, 0.3 mL insulin syringeBD324702
3 mL syringesTerumo medicalMDSS03SE
40 µm cell strainersFisher Scientific11587522
5 mL polypropylene tubes Fisher Scientific352002
5 mL polystyrene test tubes with 35 µm cell strainerFalcon352235
5 mL syringesTerumo medicalSS05LE1
50 mL centrifuge tubeFisher Scientific05-539-13
5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)MerckI7125-5g
anti-CD104 FITC (clone: 346-11A)Biolegend123605Stock = 0.5 mg/mL
anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70)Biolegend101226Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390)Biolegend102440Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11)Biolegend103116Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD9 APC (clone: KMC8)ThermoFisher Scientific17-0091-82Stock = 0.2 mg/mL
anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7)Biolegend108126Stock = 0.2 mg/mL
anti-α7 integrin PE (clone: R2F2))UBC AbLab67-0010-05Stock = 1 mg/mL
BD FACS Aria III (4 laser) instrumentBD BiosciencesN/A405, 488, 561, and 633 nm laser
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA7030-50G
Buprenorphine 0.3 mg/mLCevaVnr 054594
CD104 (Clone: 346-11A)BD Biosciences553745Dy162; In-house conjugated
CD106/VCAM-1 (Clone: 429 MVCAM.A)Biolegend105701Er170; In-house conjugated
CD11b (Clone: M1/70)BD Biosciences553308Nd148; In-house conjugated
CD29/Integrin β1 (Clone: 9EG7)BD Biosciences553715Tm169; In-house conjugated
CD31 (Clone: MEC 13.3)BD Biosciences557355Sm154; In-house conjugated
CD34 (Clone: RAM34)BD Biosciences551387Lu175; In-house conjugated
CD44 (Clone: IM7)BD Biosciences550538Yb171; In-house conjugated
CD45 (Clone: MEC 30-F11)BD Biosciences550539Sm147; In-house conjugated
CD9 (Clone: KMC8)Thermo Fisher Scientific14-0091-85Yb174; In-house conjugated
CD90.2/Thy1.2 (Clone: 30-H12)BD Biosciences553009Nd144; In-house conjugated
CD98 (Clone: H202-141)BD Biosciences557479Pr141; In-house conjugated
Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-bufferStandard Biotools201240
Cell-ID Intercalator-IridiumStandard Biotools201192Bcationic nucleic acid intercalator
CisplatinMerckP4394Pt195
Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride)MerckP4394
Clear 1.5 mL tubeFisher Scientific11926955
Collagenase, Type IIWorthington Biochemical CorporationLS004177
Counting chamberMerckBR718620-1EA
CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 )BD Biosciences551852Gd158; In-house conjugated
DAPI (1 mg/mL)BD Biosciences564907
Dark 1.5 mL tubeFisher Scientific15386548
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dissection ScissorsFine Science Tools14568-09
DMEM (low glucose, with pyruvate)Thermo Fisher Scientific11885-092
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt)MerckE5134Na2EDTA-2H20
EQ Four Element Calibration Beads (EQ beads)Standard Biotools201078Calibration beads
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil originThermo Fisher Scientific10270106
Forceps Dumont #5SFFine Science Tools11252-00
Forceps Dumont #7Hounisen.com1606.3350
Goat serumThermo Fisher Scientific16210-072
Helios CyTOF systemStandard BiotoolsN/A
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand originThermo Fisher Scientific26-050-088
IdUMerckI7125I127
Iridium-IntercalatorStandard Biotools201240Ir191/193
Isoflurane/Attane VetScanVetVnr 055226
MethanolFisher ScientificM/3900/17
Myf5 (Clone: C-20)Santa Cruz BiotechnologySc-302Yb173; In-house conjugated
MyoD (Clone: 5.8A)BD Biosciences554130Dy164; In-house conjugated
MyoG (Clone: F5D)BD Biosciences556358Gd160; In-house conjugated
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top 0.20 μM PES FiltersThermo Fisher Scientific595-4520
NotexinLatoxanL8104Resuspend to 50 µg/ml in sterile PBS. Keep stocks (e.g. 50 µl) at -20 °C
Nutrient mixture F-10 (Ham's)Thermo Fisher Scientific31550031
pAkt (Clone: D9E)Standard Biotools3152005ASm152
Pax7 (Clone: PAX7)Santa Cruz BiotechnologySc-81648Eu153; In-house conjugated
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (Pen/Strep)Thermo Fisher Scientific15140122
PES Filter Units 0.20 μMFisher Scientific15913307
PES Syringe FilterFisher Scientific15206869
Petri dishSarstedt82.1472.001
PFA 16% EM gradeMP Biomedicals219998320
Potassium chloride (KCl)Fisher Scientific10375810
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous (KH2PO4)Fisher Scientific10573181
pRb (Clone: J112-906)Standard Biotools3166011AEr166
pS6 kinase (Clone: N7-548)Standard Biotools3172008AYb172
Sca-1 (Clone: E13-161.7)BD Biosciences553333Nd142; In-house conjugated
Sodium AzideSigma AldrichS2002
Sodium chloride (NaCl)Fisher Scientific10553515
Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (Na2HPO4-6H2O)MerckS9390
Sterile saline solution 0.9%FreseniusB306414/02
α7 integrin (Clone: 3C12)MBL internationalK0046-3Ho165; In-house conjugated

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