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通过高维单细胞质谱流式细胞术鉴定和分析急性骨骼肌损伤过程中体内肌源性祖细胞
摘要
此处介绍的方案能够通过单细胞质谱流式细胞术鉴定和对肌肉干细胞和祖细胞进行高维分析，并通过 FACS 纯化它们，以深入研究其功能。这种方法可用于研究疾病模型中的再生动力学并测试药物干预的疗效。
摘要
骨骼肌再生是由成体肌肉干细胞及其后代驱动的动态过程。成体肌肉干细胞大多处于静止状态，在肌肉受伤时被激活。激活后，它们增殖，大多数后代分化产生具有融合能力的肌肉细胞，而其余的自我更新以补充干细胞库。虽然肌肉干细胞的身份是在十多年前定义的，但基于细胞表面标志物的共表达，直到最近才使用高维单细胞方法鉴定出肌源性祖细胞。在这里，我们提出了一种单细胞质谱流式细胞术 （飞行时间流式细胞术 [CyTOF]）方法，用于分析急性肌肉损伤中的干细胞和祖细胞，以解决肌肉再生过程中展开的细胞和分子动力学。该方法基于同时检测新的细胞表面标志物和关键的肌原转录因子，其动态表达能够识别代表肌发生标志的活化干细胞和祖细胞群。重要的是，描述了一种基于检测细胞表面标志物 CD9 和 CD104 的分选策略，能够使用荧光激活细胞分选 （FACS） 前瞻性分离肌肉干细胞和祖细胞，以深入研究它们的功能。肌肉祖细胞为研究肌肉干细胞命运的控制、确定肌肉疾病的新治疗靶点以及开发再生医学的细胞治疗应用提供了一个关键的缺失环节。这里介绍的方法可用于研究 体内 肌肉干细胞和祖细胞响应扰动，例如针对特定信号通路的药物干预。它还可用于研究肌肉疾病动物模型中肌肉干细胞和祖细胞的动力学，促进我们对干细胞疾病的理解并加速疗法的开发。
引言
骨骼肌是人体质量最大的组织，调节从视力到呼吸、从姿势到运动以及新陈代谢的多种功能1。因此，保持骨骼肌的完整性和功能对健康至关重要。骨骼肌组织由紧密堆积的多核肌纤维束组成，周围环绕着复杂的神经和血管网络，表现出非凡的再生潜力 1,2。
骨骼肌再生的主要驱动力是成体肌肉干细胞 （MuSCs）。也称为卫星细胞，由于其独特的解剖位置靠近肌纤维质膜和基底层下方，它们于 1961 年首次被发现3。MuSC 表达一种独特的分子标志物，即转录因子配对盒 7 （Pax7）4。它们在健康成年人中大多处于静止状态，在肌肉受伤时被激活并增殖产生后代，这些后代将 （i） 分化为具有融合能力的肌肉细胞，这些细胞将形成新的肌纤维以修复肌肉损伤或 （ii） 自我更新以补充干细胞库5。
在细胞和分子水平上，再生过程是相当动态的，涉及细胞状态转换，其特征是关键肌原转录因子的协调表达，也称为肌原调节因子 （MRF）6,7
研究方案
动物程序已获得丹麦动物实验检查局（协议 # 2022-15-0201-01293）的批准，实验按照奥胡斯大学的机构指南进行。在受伤前 24 小时在饮用水中提供镇痛剂（丁丙诺啡），以使小鼠适应味道。受伤后持续在饮用水中供应丁丙诺啡 24 小时。在急性肌肉损伤时皮下 （s.c.） 注射丁丙诺啡，注音欣注射后饮用水中的丁丙诺啡将减轻与损伤相关的疼痛。虽然建议在急性肌肉损伤时皮下注射丁丙诺啡，然后在饮用水中注射丁丙诺啡，但在受伤前在饮用水中注射丁丙诺啡是可选的。但是，研究人员必须遵守相关监管机构制定的动物福利标准和指南。
注意：对于受伤后肢肌肉的单细胞质谱流式细胞术 （CyTOF） 实验，从第 1 部分开始：肌肉损伤前 24 小时至受伤后 24 小时在水中镇痛。为了从未受伤小鼠中分选肌肉干细胞和祖细胞，执行第 5 节和第 6 节：安乐死 + 骨骼肌解剖和解离，并继续进行第 11 节：用荧光团偶联抗体对 FACS 进行染色。 实验装置和协议的概述如图 1 所示。
1. 肌肉损伤前 24 小时至受伤后 24 小时水中镇痛
- 向深色或铝箔包裹的饮水瓶中加入 3 mL 丁丙诺啡 （0.3 mg/mL），并用过滤水填充至 100 mL，以达到受....
代表性结果
在这里，我们概述了使用这种组合方法的实验设置，其中包括 （i） 通过 notexin 注射对急性损伤时间过程进行高维 CyTOF 分析，以研究骨骼肌中干细胞和祖细胞的细胞和分子动力学（图 1，上图）;（ii） 使用两种细胞表面标志物 CD9 和 CD104 对干细胞和祖细胞进行 FACS，以分离这些细胞群并对其功能进行深入研究（图 1，下图）。8.......
讨论
骨骼肌再生是一个动态过程，依赖于成体干细胞的功能。虽然以前的研究集中在肌肉干细胞在再生过程中的作用，但它们在体内的后代研究不足，主要是由于缺乏识别和分离这些细胞群的工具 15,16,17,18。在这里，我们提出了一种方法，可以在骨骼肌中同时识别和.......
披露声明
作者声明没有利益冲突。
致谢
我们感谢奥胡斯大学生物医学系 FACS 核心设施的成员提供的技术支持。我们感谢生物医学系质谱流式细胞术部门经理 Alexander Schmitz 的讨论和支持。Scientific Illustrations 是使用 Biorender.com 创建的。这项工作由奥胡斯大学 Forskningsfond （AUFF） 启动资助和诺和诺德基金会向 EP 提供的启动包资助 （0071113）。
....材料
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 20 G needle | KDM | KD-fine 900123 | |
| 28 G, 0.5 mL insulin syringe | BD | 329461 | |
| 29 G, 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| 3 mL syringes | Terumo medical | MDSS03SE | |
| 40 µm cell strainers | Fisher Scientific | 11587522 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 352002 | |
| 5 mL polystyrene test tubes with 35 µm cell strainer | Falcon | 352235 | |
| 5 mL syringes | Terumo medical | SS05LE1 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | Merck | I7125-5g | |
| anti-CD104 FITC (clone: 346-11A) | Biolegend | 123605 | Stock = 0.5 mg/mL |
| anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70) | Biolegend | 101226 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390) | Biolegend | 102440 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103116 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD9 APC (clone: KMC8) | ThermoFisher Scientific | 17-0091-82 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7) | Biolegend | 108126 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-α7 integrin PE (clone: R2F2)) | UBC AbLab | 67-0010-05 | Stock = 1 mg/mL |
| BD FACS Aria III (4 laser) instrument | BD Biosciences | N/A | 405, 488, 561, and 633 nm laser |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030-50G | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Ceva | Vnr 054594 | |
| CD104 (Clone: 346-11A) | BD Biosciences | 553745 | Dy162; In-house conjugated |
| CD106/VCAM-1 (Clone: 429 MVCAM.A) | Biolegend | 105701 | Er170; In-house conjugated |
| CD11b (Clone: M1/70) | BD Biosciences | 553308 | Nd148; In-house conjugated |
| CD29/Integrin β1 (Clone: 9EG7) | BD Biosciences | 553715 | Tm169; In-house conjugated |
| CD31 (Clone: MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | Sm154; In-house conjugated |
| CD34 (Clone: RAM34) | BD Biosciences | 551387 | Lu175; In-house conjugated |
| CD44 (Clone: IM7) | BD Biosciences | 550538 | Yb171; In-house conjugated |
| CD45 (Clone: MEC 30-F11) | BD Biosciences | 550539 | Sm147; In-house conjugated |
| CD9 (Clone: KMC8) | Thermo Fisher Scientific | 14-0091-85 | Yb174; In-house conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 (Clone: 30-H12) | BD Biosciences | 553009 | Nd144; In-house conjugated |
| CD98 (Clone: H202-141) | BD Biosciences | 557479 | Pr141; In-house conjugated |
| Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-buffer | Standard Biotools | 201240 | |
| Cell-ID Intercalator-Iridium | Standard Biotools | 201192B | cationic nucleic acid intercalator |
| Cisplatin | Merck | P4394 | Pt195 |
| Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride) | Merck | P4394 | |
| Clear 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 11926955 | |
| Collagenase, Type II | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | |
| Counting chamber | Merck | BR718620-1EA | |
| CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 ) | BD Biosciences | 551852 | Gd158; In-house conjugated |
| DAPI (1 mg/mL) | BD Biosciences | 564907 | |
| Dark 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 15386548 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| DMEM (low glucose, with pyruvate) | Thermo Fisher Scientific | 11885-092 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt) | Merck | E5134 | Na2EDTA-2H20 |
| EQ Four Element Calibration Beads (EQ beads) | Standard Biotools | 201078 | Calibration beads |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil origin | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Forceps Dumont #5SF | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Forceps Dumont #7 | Hounisen.com | 1606.3350 | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-072 | |
| Helios CyTOF system | Standard Biotools | N/A | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26-050-088 | |
| IdU | Merck | I7125 | I127 |
| Iridium-Intercalator | Standard Biotools | 201240 | Ir191/193 |
| Isoflurane/Attane Vet | ScanVet | Vnr 055226 | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/3900/17 | |
| Myf5 (Clone: C-20) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-302 | Yb173; In-house conjugated |
| MyoD (Clone: 5.8A) | BD Biosciences | 554130 | Dy164; In-house conjugated |
| MyoG (Clone: F5D) | BD Biosciences | 556358 | Gd160; In-house conjugated |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top 0.20 μM PES Filters | Thermo Fisher Scientific | 595-4520 | |
| Notexin | Latoxan | L8104 | Resuspend to 50 µg/ml in sterile PBS. Keep stocks (e.g. 50 µl) at -20 °C |
| Nutrient mixture F-10 (Ham's) | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | |
| pAkt (Clone: D9E) | Standard Biotools | 3152005A | Sm152 |
| Pax7 (Clone: PAX7) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-81648 | Eu153; In-house conjugated |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (Pen/Strep) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| PES Filter Units 0.20 μM | Fisher Scientific | 15913307 | |
| PES Syringe Filter | Fisher Scientific | 15206869 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| PFA 16% EM grade | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 10375810 | |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous (KH2PO4) | Fisher Scientific | 10573181 | |
| pRb (Clone: J112-906) | Standard Biotools | 3166011A | Er166 |
| pS6 kinase (Clone: N7-548) | Standard Biotools | 3172008A | Yb172 |
| Sca-1 (Clone: E13-161.7) | BD Biosciences | 553333 | Nd142; In-house conjugated |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 10553515 | |
| Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (Na2HPO4-6H2O) | Merck | S9390 | |
| Sterile saline solution 0.9% | Fresenius | B306414/02 | |
| α7 integrin (Clone: 3C12) | MBL international | K0046-3 | Ho165; In-house conjugated |
参考文献
- Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462 (2020).
- Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A.
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