小鼠脊髓小胶质细胞的快速高效富集

摘要

小胶质细胞被认为是体内最通用的细胞之一，能够进行形态和功能适应。它们的异质性和多功能性能够维持大脑稳态，同时也与各种神经系统病理有关。在这里，描述了一种净化脊髓小胶质细胞的技术。

摘要

脊柱定义了脊椎动物并塑造了椎管，椎管是一个包围和保护脊髓的腔体。哺乳动物中枢神经系统的正常发育和功能在很大程度上依赖于常驻巨噬细胞（称为小胶质细胞）的活性。小胶质细胞具有异质性和多功能性，可在脊髓和大脑内实现不同的基因表达和行为。许多研究探索了脑小胶质细胞的功能，并广泛地详细介绍了纯化方法。然而，小鼠脊髓中小胶质细胞的纯化缺乏全面的描述。相比之下，与未精制的提取物相比，使用高度纯化的胶原酶在中枢神经系统组织中缺乏报告。在这项研究中，从 8-10 周龄的 C57BL/6 小鼠身上切除脊柱和脊髓。随后的消化采用高度纯化的胶原酶，小胶质细胞纯化采用密度梯度。对细胞进行流式细胞术染色，通过 CD11b 和 CD45 染色评估活力和纯度。结果显示，平均存活率为80%，平均纯度为95%。总之，小鼠小胶质细胞的操作涉及用高度纯化的胶原酶消化，然后是密度梯度。这种方法有效地产生了大量的脊髓小胶质细胞群。

引言

脊椎动物的定义特征是脊柱或脊柱，其中脊索已被一系列称为椎骨的分段骨骼所取代，这些骨骼被椎间盘分割。这种骨质物质的连续性塑造了椎管，椎管是一个包围和保护脊髓^的腔1。在啮齿动物属中，脊柱通常由7个颈椎、13个胸椎、6个腰椎和数量不等的尾椎^2,3组成。脊髓的长度与脊柱的长度相似，末端丝是将脊髓固定在骶骨上的非神经结构。此外，神经纤维通过椎间孔¹ 排出。

哺乳动物中枢神经系统的发育和正常功能在很大程度上取决于神经系统常驻巨噬细胞（称为小胶质细胞⁴）的活动。尽管小胶质细胞最初被描述为大脑驻留吞噬细胞，但最近的研究将许多动态功能归因于这些细胞 ^5,6。小胶质细胞的大小在稳态中为 7 至 10 μm;它们被认为是体内用途最广泛的细胞之一，可以在形态和功能上适应不断变化的环境⁷.这些细胞在胚胎期和成体阶段都表现出高度异质性^8,9，^而在成体阶段^，

研究方案

该研究是根据墨西哥官方标准NOM-062-ZOO-1999和实验动物护理和使用指南进行的。该研究获得了墨西哥儿童医院研究、伦理和生物安全委员会 （HIM/2023/006） 和墨西哥总医院研究和生物伦理委员会 Eduardo Liceaga 的批准 （DI/21/501/04/62）。从墨西哥儿童医院获得三只 6 至 8 周龄的 C57BL/6 小鼠，在隔离条件下在通风架中饲养，符合机构动物护理和使用指南。

1.材料和试剂的制备

1. 将不含^Ca2+ 和Mg²⁺ 的PBS以及Hank平衡盐溶液（HBSS）预热至37°C。
2. 用 100 μg/mL 的 Liberase 和 4 μg/mL 的 DNase （HBSS-LD） 补充 HBSS 溶液。确保溶液的生理pH值保持在7.4。
   注意：每条脊髓需要 1 mL 的工作溶液。
3. 准备用于密度梯度离心的等渗90%溶液（市售，见 材料表）并将其预热至37°C。
4. 通过将5%热灭活胎牛血清（FBS）与PBS混合来制备染色缓冲液，并将混合物储存在冰上。
5. 将Dulbecco改良的Eagle's中高葡萄糖（1g / L）（DMEM）预热至37°C。
6. 用 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、200 U/mL 青霉素、....

讨论

由于小胶质细胞在大脑稳态中的重要性，已经开发了许多用于研究小胶质细胞的方案。在这些方法中，小胶质细胞通常来源于胚胎或新生大鼠和小鼠的大脑半球¹⁷。有限数量的研究涉及从成年小鼠脊髓中纯化小胶质细胞^13,14。这些技术包括使用胶原酶和/或木瓜蛋白酶以及DNAse进行酶消化，通常与使用Percoll或OptiPrep的梯度分离相结合。然?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL collection tubes	Corning, USA	430790
2 mL microtubes	Axygen, USA	MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR	BioLegend, USA	101302
50 mL collection tubes	Corning, USA	430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)	Gibco, USA	15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse	eBioscience, USA	48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse	BioLegend, USA	103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free	Corning, USA	46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm	Corning, USA	352340
Costar 6-well Clear Not Treated	Corning, USA	CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath	Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA	88870001
Dissecting forceps for microsurgery	FT by DUMONT
DNase	Roche, USA	4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)	Merck, USA	D6429
Electric shaver
FACS tube	Thermo, USA	352058
Fetal bovine serum (FBS)	PAN Biotech, Alemania	P30-3306
Flow cytometer Cytoflex	Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution	Merck, USA	H2387
L-glutamine	Corning, USA	15393631
Liberase TM	Roche, USA	5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers	China	1103
Pentobarbital
Percoll	Merck, USA	17089101	density gradient centrifugation
Poly-L-lysine solution	Merck, USA	P8920
Scalpel No. 25	HERGOM, Mexico	H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL	Axygen, USA	10011-680
Stereoscopic microscope	Velab, Mexico	HG927831
Straight surgical scissors (10 cm)	HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors	HERGOM, Mexico
Triton X100	Merck, USA	X100
Trypan blue Stain 0.4%	Merck, USA	15250-061
Vortex mixer	DLAB, China	8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend, USA	423102	amine-reactive fluorescent dye staining