跨空间尺度捕获基于细胞骨架的小鼠卵母细胞核搅动

摘要

该协议提供了一个实验框架来记录细胞骨架对小鼠卵母细胞系统中核形状和内部无膜细胞器的物理影响。该框架可以适用于其他细胞类型和环境。

摘要

了解女性不孕症原因的一个主要挑战是阐明控制女性生殖细胞（称为卵母细胞）发育的机制。它们的发育以细胞生长和随后的分裂为标志，这是卵母细胞与精子融合以启动胚胎发生的两个关键阶段。在生长过程中，卵母细胞重组其细胞质以将细胞核定位在细胞中心，这一事件可预测小鼠和人类卵母细胞的成功发育，从而预测其胚胎发生潜力。在小鼠卵母细胞中，这种细胞质重组被证明是由细胞骨架驱动的，细胞骨架的活动产生机械力，搅动、重新定位和穿透细胞核。因此，这种细胞质到核质的力传递调整了称为生物分子凝聚物的核RNA加工细胞器的动力学。该协议提供了一个实验框架，以高时间分辨率记录细胞骨架在小鼠卵母细胞中空间尺度上对细胞核的影响。它详细介绍了评估 i） 卵母细胞质中的细胞骨架活性，ii） 基于细胞骨架的卵母细胞核搅动，以及 iii） 其对卵母细胞核质中生物分子凝聚物动力学的影响所需的成像和图像分析步骤和工具。除了卵母细胞生物学之外，这里阐述的方法还可以适用于体细胞，以类似地解决基于细胞骨架的跨尺度核动力学调谐问题。

引言

核定位对于多种细胞和发育功能至关重要 1,2,3,4,5。名为卵母细胞的哺乳动物雌性生殖细胞重塑其细胞质，将细胞核定位在细胞中心，尽管大小不对称，这依赖于随后的染色体偏离中心⁶（图1）。细胞核的这种居中预示着小鼠和人类卵母细胞的成功发育^7,8，从而预测了它们的胚胎发育潜力（图1）。

小鼠卵母细胞中的细胞质重塑主要由肌动球蛋白细胞骨架⁹ 驱动（图2）。它的活动产生机械力，搅动、重新定位和穿透原子核¹⁰ （图 2）。因此，这种细胞质到核质的力传递调整了称为核斑点

研究方案

所有动物实验均按照欧洲共同体的指导方针进行，并得到法国农业部（授权号75-1170）和法国研究与创新总局（DGRI;转基因协议编号DUO-5291）。将小鼠饲养在动物设施中，以12小时的光/暗循环，环境温度为22-24°C，湿度为40%-50%。这里使用的小鼠包括雌性OF1（Oncins France 1,8至12周龄）和雌性C57BL / 6（10至14周龄）。

1. 卵母细胞采集和制备

1. 从8至14周龄的小鼠中收集卵母细胞，如¹⁸ 和¹⁹所述。
   1. 简而言之，首先从小鼠卵巢中提取如¹⁸ 中的卵巢到预热（37°C）M2 +牛血清白蛋白（BSA）培养基中，补充有1μM米力农¹⁹，其防止卵母细胞减数分裂恢复。
   2. 用手术针刺穿卵巢卵泡，从窦卵泡中释放生长中的卵母细胞（卵母细胞生长结束²⁰）。
   3. 使用专门用于卵母细胞收集的微量移液管收集实验（生长和/或完全生长的卵母细胞）所需大小的卵母细胞，然后用矿物油下的新鲜培养基洗涤并移入培养皿中。
2. 通过上下移液将卵母细胞从窦滤泡细胞中机械解离，并在37°C的培养箱....

讨论

该协议中的关键步骤包括在不影响卵母细胞存活或正常功能的情况下适当显微注射卵母细胞^9,10,11，以及显微注射预定义量的cRNA，以便正确可视化相关结构，如核斑点。

在研究细胞骨架如何搅动细胞核或其内部时，建立细胞质和（内）核动力学之间的联系至关重要。该协议稍作修改，通过将细胞质搅拌强?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 spinning disk	Yokogawa
DMI6000B microscope	Leica
Femtojet microinjector	Eppendorf
Fiji
Filter wheel	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software	Universal Imaging,		version 7.7.9.0
Mineral oil	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice	Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD camera	QImaging
RNAeasy kit	Qiagen	74104
SC35 antibody	Abcam	ab11826	Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Stripper Micropipette	XLAB Solutions		specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Thermostatic chamber	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows