铜绿假单胞菌产生铁载体的定性和定量分析

摘要

该方案提供来自 铜绿假单胞菌的总铁载体，pyoverdine和脓霉素的定性和定量分析。

摘要

铜绿假单胞 菌（铜绿假单胞菌）以其产生多种毒力因子以在宿主中建立感染而闻名。其中一种机制是通过铁载体的产生来清除铁。 铜绿假单 胞菌产生两种不同的铁载体：铁螯合亲和力较低的脓脓苷和铁螯合亲和力较高的脓苷。本报告表明，吡啶可以直接从细菌上清液中定量，而脓皮单在定量前需要从上清液中提取。

定性分析铁载体产生的主要方法是蓝铝磺酸铬 （CAS） 琼脂平板测定。在该测定中，Fe³⁺-染料复合物中释放的 CAS 染料导致颜色从蓝色变为橙色，表明铁载体的产生。为了定量总铁载体，将细菌上清液与微量滴定板中的CAS染料等比例混合，然后在630nm处进行分光光度分析。通过将Pyoverdine与50 mM Tris-HCl等比例混合，直接从细菌上清液中定量，然后进行分光光度法分析。380 nm处的峰证实了pyoverdine的存在。至于Pyochelin，不可能从细菌上清液中直接定量，因此必须首先提取。随后的分光光度分析显示存在 pyochelin，峰值为 313 nm。

引言

生物体需要铁来执行各种重要功能，例如电子传输和 DNA 复制¹。 铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性机会性病原体，已知具有多种毒力因子在宿主中建立感染，其中一种机制是铁载体形成²。在缺铁条件下， 铜绿假单 胞菌会释放出称为铁载体的特殊分子，这些分子会从周围环境中淬灭铁。铁载体在细胞外螯合铁，产生的铁载体复合物被主动转运回细胞³。

已知铜绿假单胞菌产生两种铁载体，pyoverdine 和 pyochelin。已知 Pyoverdine 具有较高的铁螯合亲和力 （1：1），而已知 pyochelin 具有较低的铁螯合亲和力 （2：1）⁴。脓蘑菇素也被称为次级铁载体，因为它具有较低的铁螯合亲和力⁵。铜绿假单胞菌 ⁶ 中铁载体的产生和调节受到群体感应 （QS） 系统的主动控制。

除铁淬火外，铁载体还参与调节毒力因子，并在生物^膜形成中发挥积极作用7。铁载体还发挥着其他关键作用，包括参与细胞信号传导、防御氧化应激和促进微生物群落之间的相互....

研究方案

铜绿假单胞菌的所有细菌分离株均来自印度巴罗达和斋浦尔的医学微生物学实验室。所有选定的临床分离株均在生物安全柜（BSL2）中处理，并且在实验期间处理细菌分离株时要格外小心。所有试剂/溶液的商业细节均在材料表中提供。

1. 天蓝色铬磺酸铬（CAS）染料和琼脂培养基的制备

1. 用以下组合物制备CAS染料（100mL）：
   1. 将 60 mg CAS 溶解在 50 mL 蒸馏水（溶液 1）中。
   2. 将 2.7 mg FeCl₃·6H₂O 溶于 10 mL 10 mM HCl（溶液 2）中。
   3. 将 73 mg 西曲溴铵 （HDTMA） 溶解在 40 mL 蒸馏水（溶液 3）中。
   4. 小心混合溶液 1、溶液 2 和溶液 3。将其存放在玻璃瓶中。
2. 按照以下步骤准备CAS琼脂：
   1. 将 100 mL MM9 盐溶液加入 750 mL 蒸馏水中。
   2. 溶解32.24g哌嗪-N，N'-双（2-乙磺酸）（PIPES）游离酸。
   3. 加入 15 克琼脂。高压灭菌器并使其冷却。
   4. 向混合物中加入 30 mL 无菌酪氨基酸溶液和 10 mL 无菌 20% 葡萄糖溶液。
   5. 加入 100 mL CAS 染料，....

讨论

该方案使研究人员能够从细菌游离上清液中定量铜绿假单胞菌的总铁载体和两种不同的铁载体，即pyoverdine和pyochelin。在CAS琼脂平板测定中，CAS染料和Fe³⁺离子形成络合物。当细菌产生铁载体时，它们会淬灭 CAS-Fe³⁺ 复合物中的 Fe³⁺ 离子，导致细菌生长周围的颜色发生变化。这种变化导致细菌生长周围出现明显的橙色光晕^14,15.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar, Type I	HIMEDIA	GRM666
8-Hydroxyquinoline	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chrome azurol sulfonate	HIMEDIA	RM336-10G
Citric acid	Merck	100241
Dextrose monohydrate	Merck	108342
Dichloromethane	Merck	107020
Ferric chloride hexahydrate	HIMEDIA	GRM6353
Glass Flasks	Borosil	5100021
Glass Test-tubes	Borosil	9820U05
Hydrochloric acid	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts	HIMEDIA	G013-500G
Magnesium Sulphate	Qualigens	10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer	Thermo Scientific	51119200
Peptone Type I, Bacteriological	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES free acid	MP Biomedicals	190257
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
Proteose peptone	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Sodium chloride	Qualigens	15915