使用 离体 实时成像研究小鼠牙齿更新过程中的细胞分裂和运动

摘要

离体 实时成像是一种强大的技术，用于研究活组织中细胞运动和相互作用的动态过程。在这里，我们提出了一种方案，该方案实施双光子显微镜以实时跟踪培养的全成年小鼠门牙中的牙齿上皮细胞。

摘要

不断生长的小鼠门牙正在成为一种高度易于处理的模型系统，用于研究成人上皮和间充质干细胞的调节以及牙齿再生。这些祖细胞群积极分裂、移动和分化，以维持组织稳态并以响应性方式再生丢失的细胞。然而，使用固定组织切片的传统分析无法捕捉细胞运动和相互作用的动态过程，限制了我们研究其调控的能力。本文描述了一种在外植体培养系统中维持整个小鼠门牙并使用多光子延时显微镜实时跟踪牙齿上皮细胞的方案。这项技术增加了我们现有的牙科研究工具箱，并允许研究人员获得有关活组织中细胞行为和组织的时空信息。我们预计这种方法将帮助研究人员进一步探索控制牙齿更新和再生过程中发生的动态细胞过程的机制。

引言

在过去的二十年中，小鼠门牙已成为研究成体干细胞调节和牙齿再生原理的宝贵平台^1,2。小鼠门牙在动物的一生中不断生长并自我更新。它通过维持上皮干细胞和间充质干细胞来做到这一点，这些干细胞可以自我更新并分化成牙齿的不同细胞类型 ^1,2。牙科上皮干细胞产生分泌牙釉质基质的成釉细胞，而牙科间充质干细胞产生成牙细胞、牙质母细胞和成纤维细胞，分别形成牙本质、牙骨质和牙周韧带 3,4,5,6。这种新细胞的持续供应维持了组织稳态，并允许更换因咀嚼磨损或损伤而丢失的旧细胞^7,8。因此，阐明调节牙科干细胞维持和分化的细胞和分子机制对于理解牙齿再生至关重要，这是一个越来越受关注的领域。

在解剖学上，成年小鼠门牙的很大一部分被包裹在颌骨中。当牙齿的切口边缘暴露时，门牙的顶端适合牙槽内，并通过牙周韧带和....

研究方案

所有小鼠均保存在加州大学洛杉矶分校（UCLA）或耶路撒冷希伯来大学（HUJI）的无病原体动物设施中。所有涉及小鼠的实验均根据各自机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的法规和协议进行 （ARC-2019-013;加州大学洛杉矶分校）或（MD-23-17184-3;HUJI）。实验步骤的一般工作流程如 图2A所示。有关本协议中使用的所有仪器、试剂和材料的详细信息，请参阅 材料表 。

1.溶液和凝胶的制备

1. 解剖培养基：用0.5%葡萄糖制备新鲜的DMEM / F12，并在37°C下保持温暖，直到步骤2.4需要。
   注意：我们使用不含酚红的 DMEM/F12 来减少实时成像期间的自发荧光。
2. 1x 培养基：使用 50% DMEM/F12、50% 大鼠血清、1x 谷氨酰胺替代品、1x MEM 非必需氨基酸、1% 葡萄糖、0.1 mg/mL L-抗坏血酸和 0.5% 青霉素-链霉素制备新鲜培养基。在37°C下保持温暖，直到步骤5.5需要为止。该培养基用于在实时成像期间培养门牙外植体。
   注意：大鼠血清应是高质量的，并且专门为研究人员或商业来源的全组织培养而制备。特别是，在开始形成凝血之前，必须将血液离心（在室温下以1,200× g 离心5分钟）。离心后，应挤压所得纤维蛋白凝块并丢弃

讨论

活体组织成像是一种重要的技术，使我们能够研究细胞在其生态位环境中维持时的动态过程和行为⁴¹。理想情况下，实时成像是在 体内以高 时空分辨率进行的。然而，由于组织不可接近、光学不透明以及难以长时间固定动物或器官，哺乳动物器官的 体内 成像可能具有挑战性⁴²。组织外植体绕过了其中一些挑战，并已在许多研究中成功采用，以跟?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well, flat bottom tissue culture plate	Olympus plastics	25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	11507704
Ascorbic acid (Vitamin C)	Acros Organics	352685000
D-(+)-Glucose bioxtra	Sigma Aldrich	G7528
Delta T system	Bioptechs	0420-4	Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E	Leica	LED300 SLI
DMEM/F12	Thermo Scientific	11039047	Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15)	Feather	72044-15
Fine forceps	F.S.T	11252-23
Glutamax	Thermo Scientific	35050-061	Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	n/a
low-melting agarose	NuSieve	50080
non-essential amino acids (100x)	Thermo Scientific	11140-050
penicillin–streptomycin	Thermo Scientific	15140122	10,000 U/mL
Petri dish	Gen Clone	32-107G	90 mm
Rat serum	Valley Biomedical	AS3061SC	Processed for live imaging
Razor blade #9	VWR	55411-050
Scalpel handle	F.S.T	10003-12
Scissors	F.S.T	37133
serrated forceps	F.S.T	11000-13
spring scissors	F.S.T	91500-09