小鼠上颌骨正畸模型的建立

摘要

在这里，我们逐步演示了在小鼠上颌骨模型上操作的可管理的正畸牙齿运动方案。通过对每个步骤的明确解释和视觉演示，研究人员可以掌握该模型，并通过一些修改将其应用于他们的实验需求。

摘要

由于缺乏建立小鼠上颌骨正畸模型的可重复方案，我们提出了一个可靠且可重复的方案，为研究人员提供分析机械负荷相关骨重塑的可行工具。除了不同类型的原理图、操作照片和视频外，本研究还提供了详细的流程图。我们对 11 只成年宽型 C57/B6J 小鼠进行了该方案，并在术后第 3、8 和 14 天收获了样品。显微CT和组织病理学数据已经证明了使用该协议进行牙齿移动与骨重塑相结合的成功。此外，根据第3天、第8天和第14天的显微CT结果，我们将骨建模分为三个阶段:准备阶段、骨吸收阶段和骨形成阶段。这些阶段有望帮助关注不同阶段的研究人员合理地设置样本采集时间。该协议可以为研究人员提供一种工具，以进行骨重塑的再生分析。

引言

骨骼是一种高度活跃的重建组织，在个体的一生中会调整其大小、形状和特性 ^1,2。除了荷尔蒙、衰老、营养和其他生物或生化因素³外，机械负荷是最具决定性因素的观点也得到了普遍接受^4,5。在一些机械负荷异常的情况下，骨吸收和骨形成之间的不平衡可能导致异常的骨重塑和骨骼疾病。长期卧床休息或在太空飞行中存在微重力条件下的废用性骨质疏松症和骨质流失等骨骼疾病与异常机械负荷密切相关^6,7,8。

机械负荷也被用于治疗骨骼相关疾病，如牵引治疗和正畸治疗。牵引治疗已被用于发育性疾病，如颅缝早闭和下颌骨发育不全 ^9,10，而正畸治疗已被广泛用于矫正异常的牙齿位置和任何咬合不正¹¹。正畸治疗的核心也是机械负荷的管理。当骨组织承受机械负荷时，通过骨吸收和骨形成的耦合诱导高度协调的骨重塑过程，这可以移动牙齿以达到正畸目的^12,13。

虽然正畸治疗在临床实践中得到了广泛的应用，但由于我们对机械负荷的生物学效应的认识有限，正畸治疗的结果是不可控的。为了克服这些局限性，已经建立了几种动物模型，如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴和猪，以研究机械负荷诱导的骨重塑的潜在机制（表1）14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24^{，25、26、27、28、29、30、31、32}。狗、猴子、猪等大型动物在正畸手术中比小动物有一些优势——它们有更多类似人类的牙齿和牙列，因此外科手术很容易在人类身上复制。此外，广阔的视野可以降低手术难度，并可以应用各种正畸方案^33,34。然而，大型动物很难获得，导致与样本量相关的挑战，并且它们受到伦理限制³⁵.此外，常规的提取程序和复杂的仪器使实验难以进行，因此很少使用大型动物。

在这种情况下，啮齿动物主要用于建立正畸模型。在这些模型中，与小鼠相比，大鼠和兔子的操作难度较低，牙齿运动方案更多。然而，小鼠模型具有独特的优势，即有大量转基因小鼠可用，这对于研究潜在机制尤为重要³⁶。然而，小鼠模型是最难操作的模型，因为它的体积很小。回顾目前的方法，将第一磨牙沿近中方向移动是正畸模型的唯一实用方法。两个装置主要用于移动齿形螺旋弹簧和松紧带。使用松紧带比较容易，但正畸力变化很大，很难获得稳定的结果。

Xu等^[15 ]建立了下颌骨上有螺旋弹簧的小鼠模型。然而，由于下颌骨的活动性和舌头的阻塞性，上颌骨手术始终是术中和术后考虑的首选。Taddei 等人 ¹⁶ 在 10 年前描述了鼠上颌骨的更详细方案，应该添加更多视觉和透明细节。综上所述，该方案系统地描述了小鼠上颌骨模型中详细的正畸牙齿运动方案，以帮助研究人员以标准化的方式掌握建模方法，并实现不同研究之间的比较评估。

研究方案

本研究中的动物程序由四川大学华西口腔医学院伦理委员会审查和批准（WCHSIRB-D-2017-041）。本研究使用成年C57BL / 6小鼠（参见 材料表）。该方案增加了右上颌第一磨牙 （M1） 的机械负荷，用于近中运动，其中通过骨吸收和骨形成的耦合诱导高度协调的骨重塑过程（图 1）。

1.术前准备

1. 手术项目
   1. 为手术准备以下手术物品:手术平台（图2A），紧固件（图2B），手术器械（图2C 和 补充图S1），正畸用品（图2C）和牙齿修复用品（图2D）。
      注意: 定制的螺旋弹簧是定制的，当拉伸到 10 毫米时提供 10cN 的力。
2. 灭菌
   1. 通过高压灭菌对手术器械进行消毒，并用紫外线照射对所有手术物品进行消毒至少30分钟。
3. 麻醉
   1. 通过腹腔注射给予氯胺酮（100mg / kg）和地西泮（5mg / kg）麻醉小鼠。
   2. 用棉棒将兽医软膏涂抹在小鼠的眼睛上，以避免眼睛干涩。
   3. 只有当用镊子捏住老鼠的脚趾时鼠标没有反应时，才进行手术。

2.手术过程

1. 使用胶带将麻醉小鼠的四肢以仰卧位展开并用胶带粘贴到手术平台上。
2. 在头部上方的两侧钉一根 27 G 针，在腋窝下方的两侧钉另一根 27 G 针。
3. 用橡皮筋缠绕在上面的两根针和上门牙上，用另一根橡皮筋缠绕在另外两根针和下门牙上。改变针头位置以控制张开程度和嘴的方向（图3A）。
   注意: 对于正畸牙齿移动操作，在 buccinator 完全收紧之前，请保持嘴巴最大张度。应将舌头拉向非手术侧，以暴露手术区域并防止缺血。
4. 弯曲 1.5 cm 304 不锈钢丝的 304 mm 端，并用弯曲的眼镊子将弯曲端从颊侧推过 M1 和上颌第二磨牙 （M2） 之间的相邻空间（图 3B）。当从腭侧看到结扎线的腭端时，将其拉出至其长度的一半左右，并将其穿过定制螺旋弹簧的一端。
5. 用结扎线的两端在上颌骨 M1 的近中方向打一个方形结，直到弹簧牢固地固定在牙齿上（图 3C）。减去多余的电线。
6. 同样，将第二根 3 cm 304 不锈钢丝穿过螺旋弹簧的另一端。
7. 用棉球清洁并擦干门牙表面。用棉棒在所有这些表面上涂上粘合剂并光固化。
8. 将第二根不锈钢丝推过上颌门牙之间的相邻空间，并在唇部打一个滑结（图3D）。减去多余的金属丝，使金属丝的其余部分靠近齿面。
9. 注入光固化树脂覆盖结和门牙;光固化树脂（图3E）。

3.术后管理

1. 手术后，腹膜内注射0.05mg/kg丁丙诺啡用于术后镇痛。
2. 将麻醉的小鼠放在37°C恒温电热毯上。当小鼠通过行走恢复意识时，将其放回单独的笼子中。
3. 由于手术后门牙的功能有限，请仅用软食代替常规硬饲料。
4. 每天检查正畸矫治器。如果在检查过程中观察到任何影响正畸力传导的情况，例如弹簧变形、弹簧松动和装置脱落，则应将小鼠排除在实验之外。
5. 为了保持实验的可比性，每天评估手术后小鼠的体重。任何体重减轻超过其术前体重30%的小鼠都必须被排除在实验之外。

结果

我们已经对 11 只成年雄性小鼠（C57/BL6,3 个月大）进行了 OTM 手术。他们在手术后第 3、8 和 14 天被安乐死。在这些实验中，右上颌侧是手术侧，而左上颌侧是控制侧。显微CT显示，术后第3、8和14天，M1和M2之间的距离在时间上连续增加:分别为30μm、70μm和110μm（图4）。由于机械负荷，低密度牙周韧带在远端变宽，在根部近中侧变窄（图5）。此外，牙周?...

讨论

本文试图逐步描述小鼠上颌骨模型上最简单的正畸牙齿运动方案，以研究机械负荷诱导的骨重塑的潜在机制。除了骨重塑的研究外，这种方法还有一些其他的主流应用:1）正畸牙齿运动加速的方法学研究;2）正畸根部吸收研究;3）正畸牙齿运动和疼痛的生物学机制;4）转基因模型研究。

与其他机械负荷相关治疗（如下颌牵引成骨^{术 37}）相比，正畸牙齿运动是最...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Experimental Models: Mouse Lines
C57/B6J	Gempharmatech Experimental Animals Company	C57/B6J
Critical Commercial Assays
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Biosharp	BL700B
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Instruments
27 G needle	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)
Adhesives	Minnesota Mining and Manufacturing Co., Ltd.	41282
Corkboard	DELI Group Co., Ltd.	8705
Cotton balls	Haishi Hainuo Group Co.,  Ltd.	20120047
Cotton sticks	Lakong Medical Devices Co., Ltd.	M6500R
Customized coil spring	Chengdu Mingxing Spring Co., Ltd.	1109-02
Forceps	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	none
Light-cured fluid resin	Shofu Dental Trading (SHANGHAI) Co., Ltd.	518785
Light curer	Liang Ya Dental Equipment Co., Ltd.	LY-A180
Medical adhesive tapes	Haishi Hainuo Group Co.,  Ltd.	0008-2014
Medical non-woven fabric	Henan Yadu Industrial Co., Ltd.	01011500018
Needle holders	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	none
Rubber bands	Haishi Hainuo Group Co.,  Ltd.	32X1
Surgical scissors	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	none
Tweezers	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	none