小鼠白内障手术建模

摘要

该方法通过从成年小鼠中去除晶状体纤维细胞并留下带有附着晶状体上皮细胞 （LEC） 的囊袋来模拟 体内 白内障手术。然后使用分子和形态学标准在术后的不同时间评估损伤反应。

摘要

白内障手术 （CS） 是治疗白内障的有效方法，白内障是全世界视力残疾的主要原因。然而，CS 会导致眼部炎症，从长远来看，它会导致后囊混浊 （PCO） 和/或晶状体脱位，这是由术后晶状体上皮细胞 （LEC） 过度生长及其转化为肌成纤维细胞和/或异常纤维细胞驱动的。然而，CS 导致炎症和 PCO 的分子机制仍然不清楚，因为大多数 体外 模型并没有概括 在体内看到的 LECs 的伤口愈合反应，而传统的白内障手术动物模型，如兔子，不允许基因表达的基因操作来测试机制。最近，我们的实验室和其他人成功地使用转基因小鼠来研究驱动促炎信号传导和 LEC 上皮到间充质转化诱导的分子机制，从而对 PCO 发病机制有了新的认识。在这里，我们报告了模拟小鼠白内障手术的既定方案，该方案允许通过 RNAseq 对 LEC 对晶状体纤维细胞去除的反应进行稳健的转录分析，通过半定量免疫荧光评估蛋白质表达，以及使用现代小鼠遗传学工具来测试基因的功能，这些基因被假设参与急性后遗症的发病机制如炎症以及后来 LEC 转化为肌成纤维细胞和/或晶状体纤维细胞异常。

引言

晶状体是一种高度组织化的透明组织，可折射光线以产生清晰聚焦到视网膜上的图像 ^1,2,3。这个特殊器官被不间断的基底膜（囊）包围，该膜将晶状体与眼睛的其他部分隔离开来。胶囊的内前表面锚定了单层晶状体上皮细胞 （LEC），然后在晶状体赤道分化为晶状体纤维细胞，这些晶状体纤维细胞构成了晶状体的绝大多数³。当晶状体因衰老、基因突变、紫外线辐射、氧化应激和眼外伤等因素而失去透明度时，就会发生白内障⁴。白内障是全世界失明的主要原因，尤其是在医疗条件差的国家⁵。然而，这种情况现在很容易通过超声乳化术手术切除不透明的晶状体细胞来治疗，其中去除中央晶状体囊和附着的晶状体上皮，然后使用振动探针将晶状体的细胞块分解成可以吸出的较小碎片;留下一个带有一些附属赤道 LEC 的囊袋¹.然后，最常见的是通过术后植入人工晶状体 （IOL） 来恢复视力。

虽然白内障手术 （CS） 是一种高效且微创的白内障治疗方法，但眼部炎症的发展可能会严重阻碍患者的术后恢复 ^5,6,8。这种炎症会导致术后疼痛、导致视网膜脱离的视网膜水肿，以及葡萄膜炎和青光眼等其他炎症和纤维化疾病的恶化 4,7,8,9。CS 后眼部炎症 （PCS） 通常使用抗炎滴眼液治疗，这些滴眼液受到患者依从性差或无滴白内障手术的困扰，这可能导致飞蚊症的患病率增加 ^8,10,11。从长远来看，CS 的结果可能会因后囊混浊 （PCO） 的发展而受到影响¹²。当手术后残留的 LEC 在数月至数年时发生伤口愈合反应、增殖并迁移到晶状体后囊上时，就会发生 PCO，PCS 导致继发性视力阻塞^13,14。

了解 CS 导致这种急性和慢性反应的分子机制是该领域的重大挑战，因为许多研究 PCO 的文献都依赖于通过活性转化生长因子 β （TGFβ） 治疗诱导 LEC 转化为培养物中的肌成纤维细胞^12,15。由体外培养的尸体晶状体创建的人类囊袋模型更好地反映了晶状体 PCS 的生物学特性，因为 LEC 在其天然基底膜上培养，但难以机械操纵，不能概括眼内环境，并且由于晶状体间（或供体间）的可变性而本质上是可变的^16,17。兔 ^1,18 和非人灵长类动物^19,20 白内障手术的体内模型克服了其中一些问题，但仍然不容易用于机制研究。值得注意的是，先前对哺乳动物晶状体再生的研究发现，从小鼠中去除晶状体纤维细胞后 4 周内出现显着的晶状体再生，留下晶状体上皮细胞和囊，而当整个晶状体被移除时没有发生晶状体再生^21,22。我们随后简化了该程序并对其进行优化，以研究 LEC 对晶状体纤维细胞去除的急性反应以及随后转化为具有肌成纤维细胞和纤维细胞特性的混合细胞群。 

使用这种白内障手术的小鼠模型，我们已经表明晶状体上皮细胞通过 6 小时 PCS 急剧重塑其转录组，以产生许多促炎细胞因子²³，而它们早在 24 小时 PCS^12,23，在经典 TGFβ 信号传导开始之前。使用该模型在基因敲除小鼠中的机制实验表明，LEC 的细胞纤连蛋白表达是持续纤维化反应 PCS 所必需的，这可能是由于它在纤维化 ECM 组装和细胞信号传导中的作用¹²。其他研究表明，由于αVβ8-整合素在TGFβ激活中的作用，因此它是LEC向肌成纤维细胞转变所必需的，并且这种方法识别抗PCO治疗线索的潜力被证实为αVβ8-整合素拮抗剂也阻断了LEC EMT¹⁵。

在这里，我们提供了一个详细的方案，描述了如何从活小鼠中去除晶状体纤维细胞（图 1和图 4），同时留下晶状体胶囊和 LEC 来模拟 LEC 对白内障手术的反应。

研究方案

以下协议由特拉华大学机构动物护理和使用委员会根据协议 #1039-2021-1 批准。根据视觉和眼科学研究协会 （ARVO） 关于动物在眼科和视觉研究中的应用²⁴，所有眼部存活手术只能在一只眼睛中进行。有关本协议中使用的试剂和仪器的详细信息 ，请参阅材料表 。提取晶状体纤维和缝合的替代方法如图 2 和图 3 所示。

1. 动物

1. 对于此过程，使用任何野生型或转基因实验室小鼠品系，这些小鼠品系的眼睛具有完整的晶状体。
   1. 使用 C57BL/6 小鼠作为起点，因为它们的反应在形态学和分子水平上都高度可重现^25,26。
      注意：可以使用 C57BL/6 或任何小鼠品系。在视频协议中，使用了 FVB 鼠标来更好地进行视觉演示。
   2. 使用菌株匹配的对照研究突变体对其他小鼠品系的反应。
      注意：通过练习，只要晶状体囊完好无损且晶状体没有发生明显液化，就可以在晶状体患有白内障的小鼠上执行此程序。参见转录因子 Sip1 晶状体条件性缺失小鼠的研究²⁷。
2. 对任何性别的小鼠进行此手术，最小 8 周到 24 个月^25,26。
   1. 通过练习在更年轻的小鼠（眼睑张开后）进行这种手术，尽管这会更加困难，因为这些眼睛会明显更小。
   2. 由于老年小鼠对麻醉的耐受性较低，因此请特别注意老年小鼠的手术^25,26。
      注意：手术反应的性别差异在老年小鼠中更为普遍²⁶.

2. 溶液和手术工具的制备

1. 获取麻醉剂和镇痛剂、扩张滴剂、无菌一次性手术刀、#5 杜蒙镊子、2-110 缝合钳、针头（26 G 1/2 和 27 G 45° 弯曲分配尖端 1 英寸）、注射器和平衡盐水溶液 （BSS）。
2. 在高压灭菌器中对手术器械进行消毒。

3. 麻醉前

1. 麻醉前，给小鼠各滴 1% 阿托品和 2.5% 去氧肾上腺素一滴，以扩张接受手术的眼睛的瞳孔（见 图 1A）。将眼药膏涂抹在未手术的眼睛上，以防止表面干燥。
   注意：ARVO 关于在眼科研究中使用动物的声明²⁴ 只允许一只眼睛接受生存手术，另一只眼睛保持不变，以便动物保持视力。因此，生存手术总是单侧的;然而，可以在处死前对对侧未手术的眼睛进行手术，以创建动物匹配的“时间零”对照。
2. 确保眼药水不会顺着老鼠的脸流下来进入鼻子，因为这会阻碍它的呼吸。
3. 使用无菌 26 G 1/2 针头准备带有无菌 BSS 的注射器。将注射器与无菌 27 G 45° 弯曲的 1 英寸钝分配头（以下简称分配头）安装在一起。

4. 麻醉

1. 滴眼液后，用腹膜内注射甲苯噻嗪/氯胺酮/乙酰丙嗪（35 mg/kg、80 mg/kg 和 0.5 mg/kg）溶液麻醉小鼠（图 1B）。
   注意：除非可以使用专门的鼻锥来允许进入手术所需的眼睛，否则可能无法进行吸入麻醉。

5. 做切口

1. 一旦小鼠完全处于麻醉状态，通过缺乏脚趾捏反射来衡量，并且其瞳孔已完全扩张 （2 mm）（图 4A），鼠标就可以进行手术了。
   1. 将麻醉的鼠标移动到复合解剖光学显微镜的舞台上。使用加热垫确保鼠标具有足够的热调节能力，并使用无菌窗帘。
   2. 使用解剖显微镜在 10 倍-20 倍放大倍率下观察眼睛（有关详细信息 ，请参阅材料表 ）。
2. 使用无菌手术刀在角膜中心做一个 1-1.5 毫米的切口。确保切口穿过角膜并切开前晶状体囊（图 1C 和 图 4B）。

6. 将镜片光纤与胶囊袋分离

1. 用含有无菌 BSS 的分配尖端抓住注射器，轻轻将 1 滴 BSS 喷出角膜上方，润湿表面以进行进一步操作。
2. 将透镜纤维块与透镜囊分开。
   1. 将分配尖端通过中央角膜切口插入晶状体胶囊切口，然后以圆周运动轻轻移动针头，同时缓慢释放 BSS 以分离晶状体上皮细胞和纤维细胞之间的顶端-顶端连接（水解剖），最终排出晶状体纤维块（图 1D）。
   2. 在大多数情况下，在此过程中，纤维块最终会粘附在分配尖端上（图 2A）。如果发生这种情况，请轻轻地从内眼取下分液头;并用无菌毛巾清洁以去除这些组织。重复直到去除所有晶状体纤维细胞。
   3. 或者，使用微型镊子（编号 5 Dumont）提取晶状体核（图 2B）。如果使用这种方法，请注意原始角膜切口超过核的直径，以确保易于去除。
3. 用无菌 BSS 冲洗晶状体胶囊以去除任何残留的纤维。
4. 通过显微镜观察晶状体胶囊的半透明/玻璃状外观，确认晶状体胶囊留在眼睛内（图 1E 和 图 4C）。

7. 给前房充气并缝合角膜切口

1. 通过切口将 BSS 注射到前房，将前房充气至正常深度。
   1. 向 BSS 添加感兴趣的信号通路的抑制剂或激活剂，以测试它们在晶状体损伤反应中的作用^12,15。
      注意：动物也可以用通路抑制剂进行全身治疗，这可能需要，具体取决于药物周转的药代动力学，因为手术后房水平衡重新建立¹⁵。
2. 使用 10-0 尼龙线和锥形、弯曲的 5.3 毫米 1/2c 针缝合带有方结的角膜切口（图 1F 和图 4D-F）。
   1. 在切口的中央部分放置一个方结针迹，或在原始切口的上半部分和下半部分放置两个方结针迹（见 图3）。缝数取决于角膜切口的长度。
   2. 不要一次穿刺两个角膜瓣。相反，用非惯用手用镊子握住一个角膜瓣，然后将针头/尼龙推过。一旦一侧角膜被刺破，将针头/尼龙推入下一个角膜瓣。使用方结缝合合角膜瓣。

8. 术后护理

注意：将局部抗生素软膏涂抹在眼睛上，并给予镇痛剂。小鼠在初始手术后通常不会表现出痛苦的迹象。如果需要，可以使用缓释版本的丁丙诺啡。

1. 手术后，立即执行以下子步骤。
   1. 在缝合线正上方涂抹一滴 0.5% 红霉素眼膏。确保整个切口都被药膏覆盖。
   2. 腹膜内注射丁丙诺啡 （0.1 mg/kg）。
2. 让鼠标在放置在加热垫上的笼子中从麻醉中恢复，以优化热支持。
   注意：监测动物是否有外伤、痛苦或不适的迹象。一些迹象包括手术部位感染/抓挠、缝合线移位、皮毛脱落等。

9. 监测动物恢复情况

1. 监测动物手术后的恢复情况，直到它从麻醉中醒来。
2. 手术后前 3 天每天检查小鼠。
   注意：通常不需要拆线，因为小鼠要么在完全愈合（2 周 PCS）之前被处死，要么缝线自发脱落。
3. 手术后 4-8 小时后，根据疼痛管理的需要，口服丁丙诺啡，剂量为 0.5 mg/kg（果冻）或不进食的患者为 0.1 mg/kg。或者，在手术前给予丁丙诺啡缓释剂。
   注意：在可能的情况下，应使用先发制人的镇痛药，但这可能需要调整镇痛方案，这需要机构动物护理和使用委员会的审查和批准。

10. 安乐死

1. 在手术后的所需时间对小鼠实施安乐死
   1. 使用未手术的眼作为对照组织切除了手术眼;或重新麻醉动物，对先前未手术的对侧眼进行晶状体纤维细胞去除手术，然后立即处死动物（不允许它从麻醉中醒来）以提供时间零手术控制。
   2. 确保快速解剖和组织收获。
      注意：LEC 在手术后几分钟内发生转录组变化，因此在研究早期 LEC 对手术的反应时，必须快速收集组织和固定/冷冻。

11. 对收获的晶状体组织进行进一步分析

1. 将获得的组织用于免疫染色、RNA 测序、细胞培养或蛋白质免疫分析 12,15,23,25,26,28。流式细胞术理论上也是可能的¹²，尽管小鼠晶状体中的光细胞计数很少 （~40,000）²⁹ 和手术后存在胶囊相关细胞碎片，这使得这具有挑战性。
2. 免疫染色
   1. 通过从气瓶中吸入 CO₂ （4 L/min） 对腔室中的小鼠实施安乐死。一旦小鼠失去知觉，将流速增加到 8-10 L/min，并继续这种暴露直到完全停止呼吸加 1 分钟。
      注意：可以根据 AVMA 动物安乐死指南或机构动物护理和使用委员会批准的指南或政策，使用适当的方法对小鼠实施安乐死。
   2. 通过采用辅助安乐死方法（例如宫颈脱位）确保适当的牺牲。
      注意：Duncan 实验室调查了从几分钟到几个月的时间点 PCS^12、15、23。
   3. 在人道处死小鼠后，分离手术眼进行分析。
      1. 用非惯用手握住微型镊子以抓住手术的眼睛，同时用惯用手握住微型剪刀。
      2. 轻轻夹住固定眼睛的视神经和肌肉。
         注意：处理最近手术的眼睛与需要更长时间才能治愈 PCS 的眼睛相比，要特别小心。最近手术过的眼睛在结构上更加脆弱。
   4. 将解剖的眼睛包埋在 OCT 培养基中，以便稍后进行冷冻切片、免疫染色和半定量共聚焦显微镜检查^28,30。
3. 分离胶囊袋和相关细胞，用于 RNA 测序、细胞培养或蛋白质印迹分析
   1. 通过从气瓶中吸入 CO₂ （4 L/min） 对腔室中的小鼠实施安乐死。一旦小鼠失去知觉，将流速增加到 8-10 L/min，并继续这种暴露直到完全停止呼吸加 1 分钟。
   2. 通过采用辅助安乐死方法（例如宫颈脱位）确保适当的牺牲。
   3. 如果需要早期时间点 PCS（1-2 天内），请在组织提取前拆线或在角膜上做另一个切口以提取晶状体胶囊。
      注意：在以后的时间点 PCS，缝线可能会脱落，因此需要一个新的切口。
4. 找到半透明镜头胶囊。
   1. 轻轻地将微镊子插入角膜开口，抓住胶囊，然后将其从前房中取出。
   2. 将胶囊放入 1.5 mL 微量离心管或培养皿中进行进一步分析。

结果

基于这种手术方法的结果，Duncan 实验室使用这种白内障手术的小鼠模型来构建术后晶状体上皮细胞的损伤反应时间进程（图 5）。到手术后 6 小时，5% 的晶状体上皮转录组差异表达（图 6A），包括许多速发型早期反应基因和促炎细胞因子的上调²³（图 6B）。到 24 小时 PCS 时，LEC 转录组进...

讨论

这种手术技术需要先进的鼠标处理和显微外科技能，需要实践才能发展。最难掌握的是在角膜中放置细缝合线以闭合伤口。假设实验者完全是缝合新手。在这种情况下，建议先练习使用绳子和布，然后再练习在小水果上使用大直径缝合线，以掌握制作手术方结所需的手部动作。然后，实验者必须练习用手术刀切开，然后将这些切口缝合到尺寸较小的水果（如葡萄，然后继...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Erythryomycin opthalmic ointment USP	Baush Lomb	24208-910-55
1% Atropine sulfate ophthalmic solution	Amneal	60219-1748-2
1% Tropicamide opthalmic solution USP	Akorn	17478-102-12
10-0 Nylon suture	Ethicon	7707G
2.5% Phenylephrine hydrochloride ophtahlmic solution USP	Akorn	17478-200-12
26 G 1/2 Needles - straight	BD PrecisionGlide	5111
27 G 45° bent dispensing tip 1"	Harfington
Balanced saline solution	Phoenix	57319-555-06
Bupranorphine (0.1 mg/kg)	APP Pharmaceticals	401730D
Chlorhexidine solution
Needle holder 2-110	Duckworth & Kent	2-110-3E
Noyes scissors, straight	Fine Science Tools	12060-02
SMZ800 Nikon model microscope	Nikon
Sterile disposable scalpel No.11	Feather	2975#11
Tweezers #5 Dumont	Electron Microscopy Sciences	72700-D
Xylazine/Ketamine/Acepromazine (35 mg/kg, 80 mg/kg, 0.5 mg/kg) solution	APP Pharmaceticals	401730D