在大鼠股骨皮质骨中创建箱腔缺损模型

摘要

在这里，我们提出了一种在大鼠股骨干组织中产生箱腔缺损的方案。该模型可以评估生物材料在生物力学应力下的性能，并探索与膜内成骨相关的骨再生机制。

摘要

严重的骨缺损或复杂骨折会导致严重的并发症，例如骨不连或骨愈合不足。组织工程涉及细胞、支架和细胞因子的应用，被认为是骨再生的有前途的解决方案。因此，模拟骨骼缺陷的各种动物模型在探索组织工程治疗骨愈合的潜力方面发挥着至关重要的作用。本研究建立了大鼠股骨中部的箱形皮质骨缺损模型，可作为评估生物材料促进骨愈合功能的理想模型。这种箱形皮质骨缺损是使用口腔低速手机钻孔的，并通过车床针进行成型。术后立即进行显微CT分析，确认箱腔皮质骨缺损成功建立。然后在手术后的多个时间点（0 天、2 周、4 周和 6 周）收获大鼠手术侧的股骨。使用micro-CT，苏木精和伊红（H&E）染色以及Masson三色染色评估了每个样品缺陷区域的愈合过程。这些结果表明，愈合模式与膜内骨化一致，6 周内基本愈合完成。这种动物模型的愈合过程的分类提供了一种有效的 体内 方法，用于研究在骨组织缺损愈合过程中靶向膜内骨化的新型生物材料和药物。

引言

骨折和有缺陷的骨头通常由外伤、肿瘤、炎症和先天性畸形引起 ^1,2。尽管年轻健康个体的骨组织通常具有强大的再生能力³，但超过临界尺寸的缺陷或由于全身性疾病（例如糖尿病、骨质疏松症和感染）导致的愈合障碍仍可能导致并发症，例如骨骼不连续性或愈合受损⁴。为了应对这一临床挑战，骨移植或生物材料通常用于替换严重有缺陷的骨骼或重建大骨段。然而，这些治疗有局限性。例如，尽管被认为是金标准，但自体骨移植受到供体供应限制和潜在供体部位并发症的影响 ^5,6。同种异体移植物也存在一定的风险，例如免疫介导的排斥反应、疾病的潜在传播以及对移植物的生物力学和生物学特性的负面影响⁷.

近年来，专注于骨缺损愈合机制的研究激增。替代生物材料的使用和组织工程的进步已成为骨再生领域的突出话题⁸.在这些生物材料可以应用于人体治疗之前，它们必须在体外和体内进行测试，以确保其有效性和安全性。然而，体外环境复杂性的降低以及免疫和炎症反应的缺乏限制了各....

研究方案

本研究所有动物手术均由四川大学华西口腔医学院伦理委员会（WCHSIRB-D-2021-597）审查批准。本研究使用Sprague-Dawley大鼠（雄性，体重300g）。

1. 术前准备

1. 仪器准备
   1. 本研究使用的手术器械见 图1A ：电动剃须刀、组织剪刀、眼科剪刀、眼科镊子、一次性使用手术刀、骨膜分离器、口腔低速手机、口腔探头、一次性使用冲洗吸尘器、针架、3.0缝合线。
   2. 准备一个口腔探针，并根据缺陷的直径用记号笔标记探针的大弯曲端（图1B）。使用它来确定手术过程中缺陷的大小。
   3. 使用前对用于执行该程序的所有手术材料和器械进行消毒。将所需材料包装在折叠的布或包装纸中，并用高压灭菌胶带密封以进行蒸汽灭菌（125-135°C 20-25 分钟）。
   4. 手术区域准备：喷洒75%酒精，对手术台和手术台周围环境进行消毒。在手术台上创建一个大约 60 cm x 90 cm 的无菌区域，用高压灭菌的窗帘。
2. 麻醉准备
   1. 用10%盐酸氯胺酮（50-100mg / kg）和2%甲苯噻嗪2mg / kg腹膜内麻醉大鼠。使用皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）进行术前和术中镇痛。通过脚趾捏试验检查麻醉深度。麻醉后，将无菌眼膏涂抹在眼睛上，以防....

结果

在该协议中，我们通过钻孔成功建立了尺寸为4.5 mm x 1.5 mm的大鼠股骨箱腔缺陷模型。为了分析手术侧的愈合过程，我们在术后0 d、2周、4周和6周采集了手术侧股组织，这是大鼠股骨创伤愈合过程中软骨内骨化、膜内骨化和骨重塑的关键时间^点2。在术后第 0 天，从显微 CT 位图数据重建 3D 模型显示，我们成功模拟了股骨中的箱腔缺损，其尺寸为 4.5 mm x 1.5 mm.......

讨论

临床前动物模型对于检查骨愈合和生物材料对骨再生的影响至关重要。该协议说明了股骨箱腔缺损模型，该模型复制了与临床骨再生相关的膜内骨形成过程。使用预先标记的口腔探针对缺陷区域进行术中标准化。显微 CT 和组织病理学染色结果显示，6 周内逐渐愈合，骨膜增厚，新小梁骨形成，随后皮质骨形成致密。在愈合过程中未观察到软骨组织，表明膜内成骨。这一发现为研究生物材料或药物?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.2 mm slow speed ball drill	Dreybird Medical Equipment Co., Ltd.	RA3-012	For preparation of box cavity defects
3.0 suture	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None	For suturing wounds
4% paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	For fix the femoral specimens
Cotton balls	Haishi Hainuo Group Co.,  Ltd.	20120047	For skin sterilization and cleaning of surgical field
Cotton sticks	Lakong Medical Devices Co., Ltd.	M6500R	For skin disinfection
Dental technician grinding machine	Marathon	N3-140232	For preparation of box cavity defects
Disposable scalpel	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.	20100227	For creating skin incisions as well as to sharply separate muscle tissue
Electric shaver	JASE	BM320210	Removal of hair tissue from the surgical area
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Biosharp	C1005	For the histological analysis of the specimens
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340	For the histological analysis of the specimens
Micro CT	Scanco medical ag	µCT 45	For analyzing the healing of defects in femoral samples
Needle holder	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None	For suture-holding needles
Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200	Chengdu Knowledge Technology Co.	VS200	For analyzing the results of HE staining and Masson staining
Ophthalmic forceps	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None	For clamping skin, muscle tissue
Ophthalmic scissors	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None	For forming a skin incision approach
Oral low-speed handpiece	Marathon	Y221101003	For preparation of box cavity defects
Oral probe	Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd.	20000143	For measuring the diameter of defects
Periosteal separator	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None	For blunt separation of muscle tissue
Sprague–Dawley rats	Byrness Weil Biotech Ltd	None	For the establishment of femoral bone boxy cavitary defect
Tissue scissors	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None	For forming a skin incision approach