多重活细胞成像在患者来源的癌症类器官模型中用于药物反应

Kaitriana E. Colling; Emily L. Symons; Lorenzo Buroni; Hiruni K. Sumanasiri; Jessica Andrew-Udoh; Emily Witt; Haley A. Losh; Abigail M. Morrison; Kimberly K. Leslie; Christopher J. Dunnill; Johann S. de Bono; Kristina W. Thiel

doi:10.3791/66072

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本文内容

摘要
摘要
引言
研究方案
结果
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参考文献
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摘要

患者来源的肿瘤类器官是用于基础和转化研究的复杂模型系统。本文详细介绍了使用多重荧光活细胞成像对不同类器官表型进行同步动力学评估。

摘要

患者来源的癌症类器官（PDO）模型是一种多功能研究系统，与癌细胞系相比，它更好地概括了人类疾病。PDO模型可以通过在细胞外基底膜提取物（BME）中培养患者肿瘤细胞并将其铺成三维圆顶来生成。然而，针对单层培养物中的表型测定进行了优化的市售试剂通常与 BME 不兼容。在此，我们描述了一种使用自动活细胞成像系统对PDO模型进行板化和评估药物效果的方法。此外，我们应用与动力学测量兼容的荧光染料来同时量化细胞健康和细胞凋亡。图像捕获可以自定义为在几天内以固定的时间间隔进行。用户可以在单个 Z 平面图像或来自多个焦平面的连续图像的 Z 投影中分析药物效应。使用掩蔽，计算感兴趣的特定参数，例如PDO数，面积和荧光强度。我们提供概念验证数据，证明细胞毒性药物对细胞健康、细胞凋亡和活力的影响。这种自动化动力学成像平台可以扩展到其他表型读数，以了解癌症PDO模型中的各种治疗效果。

引言

患者来源的肿瘤类器官（PDO）正在迅速成为研究癌症发展和治疗反应的强大模型系统。PDO 是三维（3D）细胞培养系统，可概括原发肿瘤的复杂基因组图谱和结构 ^1,2。与永生化癌细胞系的传统二维（2D）培养不同，PDO 捕获并维持肿瘤内异质性 ^3,4，^使其成为机制和转化研究的宝贵工具。尽管PDO正在成为一种越来越受欢迎的模型系统，但与PDO培养物相容的市售试剂和细胞效应分析方法仍然有限。

缺乏可靠的方法来分析治疗反应的细微变化阻碍了临床转化。3D 培养物中的金标准细胞健康试剂 CellTiter-Glo 3D 利用 ATP 水平作为细胞活力的决定因素 ^5,6。虽然该试剂可用于终点检测，但也有一些注意事项，最明显的是检测完成后无法将样品用于其他目的。

活细胞成像是一种复杂的动力学显微镜，当与荧光试剂结合使用时，能够量化 PDO 模型中的各种细胞健康读数，包括细胞凋亡⁷^、⁸^、⁹ 和细胞毒性¹⁰。事实上，活细胞成像一直是2D平台中化合物高通量筛选不可或缺的一部分^11,12。像Incucyte这样的系统使这项技术变得负担得起，因此可以在各种环境中为研究小组所使用。然而，这些系统在分析3D培养物中的应用仍处于起步阶段。

在此，我们描述了一种使用多重活细胞成像评估癌症PDO模型中药物反应的方法（图1）。通过对明场图像的分析，可以动力学地监测PDO大小和形态的变化。此外，随着时间的推移，可以使用荧光试剂同时定量细胞过程，例如用于细胞凋亡的膜联蛋白 V 红色染料和用于细胞毒性的 Cytotox Green 染料。所提出的方法针对 Cytation 5 活细胞成像系统进行了优化，但该协议可能适用于不同的活细胞成像平台。

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研究方案

使用人类肿瘤标本的研究由爱荷华大学机构审查委员会（IRB）审查和批准，协议 #201809807，并按照 1964 年赫尔辛基宣言及其后来的修正案中规定的伦理标准进行。获得所有参与研究的受试者的知情同意。纳入标准包括癌症诊断和肿瘤标本的可用性。

1. 将完整的 PDO 接种在 96 孔板中

准备试剂。
1. 在37°C下预热96孔板过夜，并在4°C下解冻BME。
2. 制备针对培养感兴趣的癌症类型进行优化的完整类器官培养基。用于此处所示实验的特定培养基在 补充表1中提供。
  注意:可能需要针对不同的肿瘤类型修改培养基成分。例如，类器官培养基补充有100nM雌二醇用于妇科肿瘤¹³。制备的培养基在4°C下稳定1个月。为了长期储存，将培养基等分装到50 mL管中并储存在-20°C下。
在4°C和37°C下制备两个单独的类器官培养基等分试样。例如，如果在 96 孔板中接种 60 孔，则使用 6 mL 温热的类器官培养基和 150 μL 冰冷的类器官培养基。
准备类器官洗涤缓冲液:用 10 mM HEPES、1x Glutamax、5 mM EDTA 和 10 μM Y-27632 补充 1x PBS。储存在4°C
收获在 24 孔板中培养的 PDO。除非另有说明，否则在冰上或4°C下执行所有步骤。
1. 使用真空管路系统从每个孔中抽吸介质。
2. 加入 500 μL 冰冷类器官洗涤缓冲液，并使用 1000 μL 移液器轻轻移液 2-3 次。将板在冰上孵育10分钟。
3. 将每个孔的内容物转移到 50 mL 锥形管中。为确保所有 PDO 都处于悬浮状态，用额外的 300 μL 类器官洗涤缓冲液冲洗每个孔并转移到 50 mL 锥形管中。在4°C下以350× g 离心5分钟
4. 使用真空管路系统从 BME/类器官沉淀中抽出上清液，在管中剩余 ~ 5 mL。加入 20 mL 类器官洗涤缓冲液，并使用 10 mL 血清移液管轻轻重悬沉淀。在冰上孵育10分钟。
5. 在4°C下以350× g 离心5分钟。用真空管路系统吸出上清液，注意不要破坏PDO沉淀。
在 96 孔板中铺板 PDO:除非另有说明，否则在冰上执行所有步骤。
1. 将PDO沉淀重悬于适量的冰冷类器官培养基中，以产生PDO悬浮液。将PDO悬浮液转移到冰冷的1.5mL微量离心管中。
  注意:要计算类器官培养基的量，请确定要在 96 孔板中接种的孔数，同时考虑到 PDO 以 1:1 的类器官培养基和 BME 比例接种在 5 μL 圆顶中。例如，当铺板一个 96 孔板并仅使用内部 60 孔时，所需的 PDO 悬浮液总量为 300 μL:150 μL 类器官培养基和 150 μL BME。对于在不同百分比的 BME 下表现出最佳生长的模型，在此步骤中可以修改 BME: 培养基的比率，但必须对每个特定模型的所有检测中的比率进行标准化。为了解决移液误差，向每个组分添加 10% 的体积。
2. 计算 PDO 的数量。
  1. 将 2.5 μL PDO 悬浮液转移到冰冷的 1.5 mL 微量离心管中，并与 2.5 μL BME 混合。将 5 μL 混合物转移到干净的玻璃显微镜载玻片上。不要盖玻片。混合物将凝固成圆顶。
  2. 使用4倍的明场显微镜进行可视化。计数 5 μL 混合物中的 PDO 数量;目标是每 5 μL 圆顶大约有 25-50 个 PDO。
    注意:如果在测试混合物中未达到所需的密度，则通过添加更多的类器官培养基或离心PDO悬浮液并将PDO沉淀重悬于较低体积的冰冷类器官培养基中来调整PDO悬浮液的最终体积。无论在此步骤中如何修改PDO悬浮液，BME的最终比率:步骤1.5.3中的PDO悬浮液。应为 1:1。
3. 使用具有宽口径吸头的 200 μL 移液器，将 PDO 悬浮液与等量的 BME 小心混合，以达到类器官培养基与 BME 的 1:1 比例。避免气泡，这会破坏圆顶的完整性。
4. 使用 20 μL 移液器，将 5 μL 圆顶接种到预热的 96 孔板的每个孔的中心，仅接种内部 60 孔。为确保 PDO 的均匀分布，定期使用带有宽口径吸头的 200 μL 移液器移取 1.5 mL 管的内容物。
5. 播种完所有孔后，将盖子放在板上并轻轻倒置。将倒置的板在37°C下在组织培养箱中孵育20分钟，以使圆顶凝固。
  注意:倒置板可确保 BME/类器官培养基圆顶保留 3D 结构，为 PDO 形成提供足够的空间。
6. 翻转板，使其盖上盖子，并在37°C下孵育5分钟。

2. 多重处理和荧光染料的添加

当 BME 圆顶在 96 孔板中凝固时，准备荧光活细胞成像试剂的稀释液。本文给出了膜联蛋白V红染料和细胞毒素绿染料的多重检测的具体参数。
荧光试剂制备（第 -1 天）:假设每个孔将用 100 μL 染料定量培养基处理，根据要处理的孔数计算类器官培养基的适当体积。在预热的类器官培养基中将染料稀释至所需浓度。
注意:所需的培养基总量会因实验而异。在最终体积中加入 10% 以解决移液误差。例如，要处理 96 孔板的内部 60 孔，制备 6.6 mL 染料定量培养基（表 1）。
用 100 μL 2x 染料剂量的类器官培养基处理每个孔。将 200 μL 无菌 1x PBS 加入板的外部空孔中。在37°C孵育过夜。
注意:外周孔中的PBS减少了内孔中介质的蒸发。
添加药物/治疗剂（第 0 天）:在预热的类器官培养基中以 2 倍浓度在每孔 100 μL 的体积中制备药物。
注意:DMSO在高浓度下可能对细胞有毒。在本研究中进行的实验中不超过0.1%DMSO的浓度。除药物外，一些荧光试剂以DMSO溶液的形式分发。在使用此类试剂时，必须考虑DMSO总浓度。
向每个孔中加入 100 μL 2x 染料定量培养基;避免产生气泡。

3. 设置成像参数

将板放入细胞化 5 中。打开 Gen5 软件。单击" 新建任务">"成像器手动模式"。选择 立即捕获 并输入以下设置: 物镜（选择所需的放大倍率）; 过滤器（选择微孔板）; 微孔板规格（选择孔数）;和 容器类型（选择板类型）。单击 "使用盖 子"和 "使用较慢的载波速度"。单击 "确定"。
注意:容器类型:在选择有关板的信息时，请尽可能具体，因为软件已针对每种板类型和塑料厚度校准为从物镜到板底部的特定距离。
较慢的载体速度:选择此框可避免在装载/卸载板时损坏圆顶。
创建一个 Z-Stack，该 Z-Stack 将对整个 BME 圆顶进行映像。
1. 选择要查看的感兴趣孔（直方图下方的左侧面板）。
2. 选择 明场通道（左面板，顶部）。单击 自动曝光 并根据需要调整设置。
3. 设置 Z-Stack: Expand Imaging Mode 选项卡（左侧面板，中间）的底部和顶部。选中 Z-Stack 框。使用航向调整箭头（左侧面板，中间），单击向下调整，直到所有 PDO 进入，然后失焦并模糊不清。将其设置为 Z-Stack 的底部。使用航向调整箭头向相反方向重复，以设置 Z-Stack 的顶部。
4. 为确保 Z-Stack 设置适用于其他感兴趣的孔，请选择另一个孔（左侧面板，直方图下方）并可视化 Z-Stack 的顶部和底部。
5. 要手动输入焦距位置，请单击微调旁边的三个点（左侧面板，顶部）。将打开一个窗口;键入顶部的 Z-Stack 值（位于左侧面板中间 的"成像模式"下）。对底部的 Z-Stack 值重复上述步骤。根据需要进行调整，通过重复步骤 3.2.3 捕获所需的 Z 范围。如果需要调整，请选择另一个孔以验证设置。
设置荧光通道的曝光设置。描述了两个荧光通道（GFP和TRITC）的设置。荧光通道的具体数量将取决于实验以及活细胞成像系统中安装的荧光立方体。
注意:如果预计在实验结束时信号强度会明显更高，用户应考虑执行测试实验，以确定实验结束时的最佳曝光设置，然后在设置初始参数时可以应用该设置。
1. 展开 "成像模式 "选项卡（左侧面板，中间）并打开 "编辑成像步骤"。将出现一个弹出窗口。
2. 在 "通道"下，单击所需通道数的气泡。为明场指定一个通道，为每个荧光通道指定其他通道。在此示例中， 通道 1 = 明场; 通道 2 = GFP; 通道 3 = TRITC。使用下拉颜色菜单，为每个通道选择适当的设置。单击 "确定"关闭编辑窗口。
3. 设置每个荧光通道。
  1. 将通道切换到 GFP（左面板，顶部）。
  2. 单击 "自动曝光"（左面板，顶部）。展开 "曝光 "选项卡（左侧面板，中间）并调整曝光设置以最大程度地减少背景信号。
  3. 按照步骤 3.3.3.3-3.3.3.6 将曝光设置复制到 "图像模式 "选项卡。
  4. 单击"编辑成像步骤"框旁边的"复制"图标。单击"编辑映像步骤"（Edit Imaging Step），这将打开另一个窗口。
  5. 在GFP通道下，单击"曝光"行中的"剪贴板"图标，将"照明"、"积分时间"和"相机增益"设置添加到通道。
  6. 对 TRITC 通道重复步骤 3.3.3.4-3.3.3.5。单击 "确定 "关闭窗口。
设置图像预处理和 Z 投影步骤以自动执行图像预处理。
1. 单击相机图标（左面板，下角）。将打开一个新窗口。
2. 在 "添加处理步骤"（左面板，底部）下，单击 "图像预处理"。将打开一个新窗口。
3. 在 "明场 "选项卡上，取消选择 "应用图像预处理"。
4. 对于每个 荧光通道 选项卡，请确保选中 "应用图像预处理 "。取消选择 "使用与通道 1 相同的选项 "，然后单击 "确定"。窗口将关闭。
5. 在 "添加处理步骤"下，单击 "Z 投影"。将打开一个新窗口。如果需要，调整切片范围（例如，缩小 Z 范围）。通过选择 "确定"关闭窗口。
创建协议。
1. 单击工具栏中 的图像集 。在下拉菜单中，点击 从此映像集创建实验。 "成像窗口"（Imaging Window ）将关闭，" 过程窗口"（Procedure Window ）将打开。
  注意:在 成像器手动模式 下选择的参数将自动加载到新窗口中，从而可以创建实验方案。
2. 设定温度和渐变:点按"操作"标题（左侧）下的"设定温度"。将打开一个新窗口。选择"培养箱开启"，然后在"温度"下手动输入所需温度。接下来，在"渐变"下，手动输入 1。通过选择"确定"关闭窗口。
  注意: 创建 1 °C 梯度将防止在板盖上形成冷凝水。
3. 为映像指定孔。
  1. 双击"描述"下的"图像步骤"。单击"全板"（右上角）。这将打开"板布局"（Plate Layout）窗口。
  2. 使用光标突出显示感兴趣的井。单击 "确定"。如果需要，请选中" 自动对焦合并 "和 "捕获合并 "框。单击 "确定 "关闭窗口。
    注意:像素合并需要调整曝光，如上述步骤 3.3.3.2 所述。有关可能使用此功能的具体场景，请参阅讨论部分。
4. 设置动力学成像的间隔。
  1. 单击"其他"标题（左侧）下的"选项"。选中"不连续动力学程序"框。
  2. 在 "估计总时间"下，输入实验的运行时间（例如，5 天）。在 "估计间隔"下，输入对板进行成像的间隔（例如，每 6 小时一次）。
  3. 每次运行后单击"暂停"，以便有时间将板转移到培养箱中。通过选择"确定"关闭窗口。
5. 更新数据缩减步骤。
  1. 单击" 确定 "关闭 "过程窗口"。将打开一个选项卡以更新数据缩减步骤。选择 "是"。双击 图像预处理。单击不同的通道以验证设置，然后单击确定。
  2. 双击 Z 投影。单击不同的渠道以验证设置。单击 "确定"。然后，再次单击 "确定 "以关闭 "数据缩减窗口"。
6. 格式化印版布局。
  1. 打开 孔板布局向导 ，按照步骤 3.6.2-3.6.3 指定孔类型。
  2. 单击工具栏中的" 孔板布局 "图标（左上角）以打开 "孔板布局向导"。
  3. 选中实验中使用的孔类型旁边的框。在 "检测对照"下，使用箭头输入不同对照类型的数量。单击 "下一步 "打开" 检测对照 #1 "窗口。
  4. 按照步骤 3.6.5-3.6.8 设置测定对照孔条件。
  5. 在" 检测对照 #1"窗口中，在 "孔板布局 ID "框中输入对照标签。如果需要，请在相邻的框中输入全名。使用箭头选择相应控制条件的重复数。
  6. 如果在对照中使用多个浓度或稀释系列，请单击 定义稀释度/浓度 ，然后使用下拉菜单选择类型。在表中输入每种浓度/稀释度的值。
    注意: 如果浓度以一致的增量变化，则可以使用自动功能。
  7. 选择工具栏中的 "颜色" 选项卡。在下拉菜单中选择所需的文本颜色和背景颜色进行控制。单击 "下一步"。
  8. 根据需要对其他控件重复上述步骤。
  9. 按照 3.6.10-3.6.12 设置样品井条件。
  10. 在"示例设置"页上，输入示例 ID 前缀（例如 SPL）。使用箭头选择重复次数。如果使用具有不同处理浓度的样品，请在类型下拉菜单中选择浓度或稀释度。在表格中输入稀释度/浓度，然后在单位框中输入单位。
  11. 在工具栏中选择 标识字段 。在表格中输入所需的 类别名称 （例如，样品 ID、药物）。
  12. 选择工具栏中的 "颜色 "选项卡。为每个治疗组/样品选择不同的颜色。单击 "完成"。这将打开"板布局"页面。
    注意:左侧的数字与不同的样本编号相关。
  13. 按照步骤 3.6.14-3.6.16 分配示例 ID。
  14. 选择左面板中的 SPL1。使用光标选择孔。
    注: 可以在串行分配框中调整自动选择工具。可以预先指定布局的重复次数和方向。
  15. 对其他样品重复以完成板布局。满意后， 单击" 确定"。
  16. 在 "文件 "工具栏中，选择 "示例 ID"。在 "样品 ID" 列中填写每个样品的相应信息（例如，药物类型）。按 OK。
7. 保存协议。
  1. 在工具栏中，单击"文件">"将协议另存为"。选择保存文件的位置。输入文件名。单击"保存"关闭窗口。
  2. 单击工具栏中的 "文件">"退出 "。将打开一个选项卡，用于保存对 成像器手动模式的更改。 选择 "否"。
  3. 将打开一个选项卡，用于保存对实验 1 的更改。选择 "否"。将打开一个选项卡以更新协议定义。选择 "更新"。关闭软件。
将实验方案导入BioSpa OnDemand并完成实验设置。
1. 打开BioSpa OnDemand（调度软件）软件。
2. 在软件中选择一个可用的插槽。
3. 从活细胞成像系统中取出板。单击 "打开抽屉 "以访问调度软件中的相应插槽并插入板。单击 "关闭抽屉"。
  注意:在上面的步骤 3.5.7 中创建协议后，可以在任何时候执行此步骤。但是，板必须在 Cytation 5 中才能执行以下步骤 3.6.4.3 中的定时运行。
4. 导入协议。
  1. 在 "过程信息 "选项卡下，在下拉菜单中选择 "用户 "。在"协议 "槽旁边，单击 "选择">"添加新条目"。
  2. 在"协议"插槽旁边，单击 "选择"。这将打开一个新窗口，以导航到文件架构中所需的协议。单击 "打开 "将协议导入调度软件。
  3. 输入对印版进行成像所需的时间。单击 "确定 "关闭 Gen5 协议列表 窗口。
    注意:当一次运行多个实验时，此步骤尤为重要。要确定映像所需的时间，请单击 "立即执行计时运行"。单击 "确定"。
5. 设置成像间隔并安排实验。
  1. 在间隔下，输入步骤 3.5.4 中指定的成像间隔。
  2. 在 "开始时间选项"下，选择 "可用时"。在 "持续时间"下， 选择"固定 "或 "连续"。
    注意:可以指定特定的开始时间，而不是在下一个可用时间运行协议。选择 "固定持续时间 "将为实验设置特定的终结点，并要求用户指定实验时间范围。 "连续持续时间 "将允许实验在没有终结点的情况下运行，并且只能通过用户停止实验来结束。
  3. 单击 "计划板/容器"（Schedule Plate/Vessel）。这将打开板验证序列。将打开一个选项卡，其中包含建议的首次读取时间。单击 "是 "接受此计划。

4. Gen5 软件中的图像分析 （图 2）

打开图像分析模块。
1. 打开 Gen5。在 任务管理器中，选择 "实验>打开"。选择实验以打开文件。单击工具栏中的 "板>视图 "。
2. 将 "数据 "下拉菜单更改为 "Z 投影"。双击感兴趣的井。选择 分析> 我想设置新的影像分析数据缩减步骤。单击 "确定"。
细胞分析
1. 主掩模
  1. 在 "分析设置"下，选择 "类型:蜂窝分析和检测通道:ZProj[Tsf[明场]] （左侧面板，中间）。
  2. 单击 "选项"。这将打开 "主要掩码和计数 "页面。在 "阈值 "框中，选中" 自动 "，然后单击 "应用"。单击 "突出显示对象 "框（右侧面板，底部）以显示指定阈值内的对象。根据需要进行调整以包括感兴趣的对象。
    注意:阈值设置基于像素强度。例如，如果阈值设置为 5000，则强度大于 5000 的像素将包含在分析中。
  3. 在 "对象选择"（Object Selection）下，指定最小和最大对象大小（μm）。根据需要进行调整以排除细胞碎片/单细胞。
    注意: PDO 大小可能在不同型号和类型之间有很大差异。使用 Gen5 软件中的测量工具确定每个型号的最小和最大 PDO 大小阈值。用户可以选择相对于测量工具提供的值更小的最小 PDO 大小阈值，以防止在药物治疗后的后期时间点排除 PDO 片段。
  4. 要将分析限制在孔的某个区域，请取消选择 分析整个图像 ，然后单击插入。在 "图像插件 "窗口中，使用下拉菜单选择 "插件 形状"。根据需要调整尺寸和位置参数以适合感兴趣区域。
    注意: 重要的是要最大限度地增加插头内的 PDO 数量，同时还要排除无 PDO 的区域以最大限度地减少背景。指定一个插头大小，以便在重复过程中始终如一地捕获大多数感兴趣的对象。生成一个排除圆顶边缘的塞子很重要，因为它排除了由于圆顶边缘周围极端曲率的光折射而可能出现扭曲的任何物体。也可以取消选择 包含主边缘对象 ，以仅捕获插头内的整个 PDO。
2. 亚群分析。 图 3 提供了亚群指定的示例。
  1. 单击"蜂窝分析"工具栏中的"计算指标"。单击"选择"或创建感兴趣的对象级指标（右下角）。在"可用对象"指标下，选择感兴趣的指标（例如，循环度），然后单击"插入"按钮。单击"确定"。
    注意:每个PDO模型的形态和密度将确定区分亚群的最佳目标指标。
  2. 单击"细胞分析"工具栏中的亚群分析。单击添加以创建新的子群体。将打开一个弹出窗口。
  3. 如果需要，请输入子群体的名称。在 "对象指标"下，选择感兴趣的指标，然后按 "添加条件"。在 "编辑条件 "窗口中，输入所选 对象指标的参数。根据需要对其他指标重复上述步骤。
    注意: 参数可以手动调整或使用查找工具进行设置。例如，要排除碎片，用户可以将面积添加为 对象度量 ，并选择小于 800 的对象。通常使用循环度作为 对象度量 ，并且包括任何循环度大于 0.2-0.5 的对象，具体取决于模型。
  4. 在窗口底部的表格中，选中要显示的所需结果。单击 "确定">"应用"。
  5. 要查看子群体中的对象，请使用 对象详细信息 下拉菜单（右侧面板，中间）选择子群体。落在参数范围内的对象将在图像中突出显示。
    注意:要更改主蒙版和子群体的高亮颜色，请单击设置（右侧面板底部）。
  6. 要调整子种群参数，请从"细胞分析"工具栏中重新打开"子种群分析"窗口。选择子群体，然后单击编辑。单击"添加步骤"。
    注意:这将在所有时间点对实验中的所有孔应用相同的分析。在 Matrix 页面的下拉菜单中，可以选择不同的指标进行单独查看。

5. 将数据从 Gen5 导出到 Excel

要自定义要导出的数据文件，请选择工具栏中的 "报告/导出生成器" 图标。在弹出窗口中，单击 "新建导出到 Excel"。
在弹出窗口的 "属性 "页上，选择 "范围>板和内容">"自定义"。单击工具栏中的 "内容 "选项。单击 "编辑模板"，这将打开 Excel 程序。
在电子表格中，选择" 外接程序">"表>井数据"。将鼠标悬停在各种选择上可查看导出选项。选择感兴趣的指标（例如，对象均值[ZProj[Tsf[TRITC]]]）。
注:通过选择 "附加模块">"方案摘要">"布局"，可以将孔板布局添加到电子表格分析模板中。
将打开" 编辑 "窗口。在 "孔 "框中，按 Well-ID 或 Well # 指定要导出的孔。选择 "确定"。模板将加载到电子表格文件中。关闭电子表格。模板将自动保存。
单击"新建导出到 Excel"窗口中的"确定"，然后关闭"报表/导出生成器"窗口。
单击 Gen5 工具栏中的 "导出 "图标。选中所需导出文件旁边的框。单击 "确定"。Gen5 将自动填充电子表格模板并在 Excel 中打开文件。

6. 外部数据分析

在Excel中打开导出文件（.xlsx）。
对于每个孔，将每个单独的值除以该孔的 0:00 时间点值。这会将时间点 0 设置为 1，超出该值的每个值都将与初始读数相关。
在数据分析软件中打开一个新文件。选择" XY 布局 "选项。
注意:在此协议中，使用了GraphPad Prism（版本9.5.1）。
每个数据组的输入标签。将每个处理组的时间点和相应的归一化值复制并粘贴到 Prism 表中。数据的图表将自动生成，可以在 "图表"下找到。

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结果

我们的目的是证明使用多重活细胞成像来评估PDO治疗反应的可行性。在两个独立的子宫内膜癌PDO模型中进行了概念验证实验:ONC-10817和ONC-10811（ONC-10811数据见 补充图1 和 补充图2 ）。细胞凋亡（膜联蛋白 V 染色）和细胞毒性（Cytotox Green 摄取）对细胞凋亡诱导剂星形孢菌素进行动力学监测。具体而言，将PDO接种在96孔板中，用Annexin V Red和Cytotox Green染料处理，并置于37°C培养...

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讨论

PDO 培养物因其能够反映细胞反应和行为而成为越来越流行的体外模型系统²。PDO的产生、培养和扩增技术已经取得了重大进展，但分析治疗反应的方法却滞后了。市售的 3D 活力试剂盒是裂解终点测定，错过了潜在有价值的动力学响应数据，并限制了其他方法的后续分析⁸。新兴研究正在应用活细胞成像来评估PDO模型中的药物反应。在这里，我们提出了一种利用多...

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披露声明

KWT 是 Immortagen Inc. 的共同所有人，CJD 是安捷伦的员工。JSdB曾在安进、阿斯利康、安斯泰来、拜耳、Bioxcel Therapeutics、勃林格殷格翰、Cellcentric、第一、卫材、基因泰克/罗氏、Genmab、葛兰素史克、鱼叉、ImCheck Therapeutics、Janssen、Merck Serono、Merck Sharp & Dohme、Menarini/Silicon Biosystems、Orion、Pfizer、Qiagen、Sanofi Aventis、Sierra Oncology、Taiho、Terumo和Vertex Pharmaceuticals等公司担任顾问委员会委员;是癌症研究所（ICR）的一名雇员，该研究所的研究工作已获得 AZ、安斯泰来、拜耳、Cellcentric、第一、基因泰克、Genmab、葛兰素史克、杨森、默沙东、美纳里尼/Silicon Biosystems、Orion、赛诺菲安万特、Sierra Oncology、Taiho、辉瑞和 Vertex 的资助或其他支持，并且在阿比特龙、PARP 抑制 DNA 修复缺陷癌症方面具有商业利益，和PI3K/AKT通路抑制剂（无个人收入）;被指定为发明人，对Janssen提交的专利8 822 438没有经济利益，该专利涵盖了醋酸阿比特龙与皮质类固醇的使用;曾是许多行业赞助的临床试验的CI/PI;并且是美国国家卫生研究所（NIHR）高级研究员。没有其他作者有任何潜在的利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢爱荷华大学的组织采购核心和 Kristen Coleman 博士提供患者肿瘤标本，并感谢妇产科的 Sofia Gabrilovich 博士协助生成 PDO 模型。我们还要感谢 Valerie Salvatico 博士（美国安捷伦）对手稿的批判性分析。我们感谢以下资金来源:NIH/NCI CA263783 和 DOD CDMRP CA220729P1 KWT;英国癌症研究中心、英国前列腺癌协会、前列腺癌基金会和医学研究委员会对 JSdB。资助者在实验的设计或分析或发表决定中没有任何作用。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)

参考文献

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