识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境群体

摘要

本文介绍了从骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病的小鼠模型中分离和表征骨髓微环境群体的详细方案。该技术可识别非造血骨髓生态位（包括内皮细胞和间充质基质细胞）随疾病进展的变化。

摘要

骨髓微环境由不同的细胞群组成，例如间充质基质细胞、内皮细胞、骨系细胞和成纤维细胞，它们为造血干细胞 （HSC） 提供支持。除了支持正常的造血干细胞外，骨髓微环境还在造血干细胞疾病的发展中发挥作用，例如骨髓增生异常综合征 （MDS） 和急性髓系白血病 （AML）。造血干细胞中 MDS 相关突变导致分化受阻和进行性骨髓衰竭，尤其是在老年人中。MDS通常可进展为难治性AML，这是一种以未成熟髓母细胞快速积累为特征的疾病。已知这些骨髓肿瘤患者的骨髓微环境会发生变化。在这里，描述了从骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病的小鼠模型中分离和表征骨髓微环境细胞的综合方案。分离和表征骨髓生态位群体的变化有助于确定它们在疾病发生和进展中的作用，并可能导致开发针对骨髓基质群体中促癌改变的新疗法。

引言

骨髓微环境由造血细胞、非造血基质细胞和细胞外基质^{组成 1,2}。这种微环境可以促进造血干细胞自我更新，调节谱系分化，并为骨组织提供结构和机械支持1,2,3,4,5。基质生态位包括骨系细胞、成纤维细胞、神经细胞和内皮细胞⁶，而造血生态位由淋巴和髓系群体^{组成 1,2,3}。除了支持正常的造血干细胞外，骨髓微环境还可以在造血干细胞疾病的发展中发挥作用，例如MDS和AML 7,8,9,10,11。<....

研究方案

所有动物实验均按照罗切斯特大学动物资源委员会批准的方案进行。小鼠在罗切斯特大学的动物护理设施中饲养和饲养。为了模拟高危 MDS，采用了市售的 NHD13 小鼠模型¹⁹。在该模型中，在疾病发作前 8 周龄的雌性 NHD13 小鼠中分析骨髓基质细胞。De novoAML的生成如前所述^6,11,20。用于诱导 AML 的癌基因，例如 MLL-AF9 和 NRas，用 GFP 或 YFP 标记，允许使用流式细胞术分析非白血病 GFP-骨髓群体。简而言之，将10周龄的雌性C57BL / 6J小鼠移植小鼠GFP / YFP + AML细胞，并在移植后2周收获骨髓。虽然本研究中使用雌性小鼠进行演示，但该协议可以在雄性或雌性小鼠中进行。它也可以使用一根股骨或所有长骨进行。

1. 骨髓采集

注意：有关动物解剖方案的详细信息，请参阅Amend等人²⁶。

1. 用70%乙醇清洁研钵和研杵，用冷却的FACS缓冲液冲洗（表1），并在开始收获之前将它们放在冰上冷却。此外，....

讨论

小鼠白血病模型已被广泛用于识别促进侵袭性髓系白血病进展的细胞内在和生态位驱动信号^6,19,21。本文介绍了一种基于流式细胞术的综合方案，用于定义MDS和AML小鼠模型中骨髓微环境的细胞组成。

在从实验样品中获取流式细胞术数据之前，仔细补偿荧光重叠非常重要。包括所有适当的染色和门控也很重要.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette Tips	Genesee Scientific	24-165RL
1.7 mL Microcentrifuge Tubes	AVANT	L211511-CS
10 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-140RL
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1760
1000 mL Vacuum Filtration Flask	NEST	344021
15 mL Centrifuge Tube	VWR	10026-076
2 mL Aspirating Pipette	NEST	325011
200 µL pipette Tips	Genesee Scientific	24-150-RL
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1780
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes	Globe scientific	1740
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube  12 x 75 mm style	Falcon	352054
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style	Falcon	352235
50 mL Centrifuge Tube	NEST	602052
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid	Falcon	353046
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56616-031
APC MicroBeads	Miltenyi	130-090-855
autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec GmBH	4425745
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141	0.5 mg/mL
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906	66.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)	Invitrogen	404-5981	0.2 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory	664
Carbon Dioxide Gas Tank	Airgas	CD50
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7	Invitrogen	25-0311-82	0.2 mg/mL
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC	Invitrogen	17-0451-82	0.2 mg/mL
Cell Strainer 70 µm Nylon	Falcon	352350
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL	Cole-Parmer	EW-63100-62
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138-500MG
Collagenase Type I	STEMCELL	7415
Corning Mini Centrifuge	CORNING	6770
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller	Corning	4099
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	D4513
Dispase II, powder	Gibco	117105041
DPBS 10x	gibco	14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)	VWR	89125-174
Fine scissors - sharp	Fine Science Tools	14061-10
Foundation B Fetal Bovine Serum	GeminiBio	900-208
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits	FisherScientific	F167370G
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x	gibco	14185-052
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Incubator	BINDER	C150-UL
Kimwipes	KIMTECH	K222101
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet	Nuaire	NU-425-400
LD Columns	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-901
LSE Vortex Mixer	CORNING	6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1	Becton, Dickinson and Company	647800L6
MACS MULTI STAND	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-303
MACsmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-753
mIgG	Millipore-Sigma	18765-10mg	2 mg/mL
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice	Jackson Laboratory	010505
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)	Biolegend	104106	0.2 mg/mL
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)	Biolegend	135920	0.2 mg/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	10,000 U/mL
Plastipak 3 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309657
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher Scientific	P3566
QuadroMACS  Separator	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge	Thermo Scientific	75009521
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC	Invitrogen	17-5921-82	0.2 mg/mL
Trypan Blue Solution 0.4%	Gibco	15-250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-038