良性胃体和胃窦上皮活检患者来源的胃类器官的建立和表征

摘要

胃患者来源的类器官在研究中得到了越来越多的应用，但缺乏从具有标准化接种密度的单细胞消化物中生成人胃类器官的正式方案。该协议提出了一种从上消化道内窥镜检查期间获得的活检组织可靠地创建胃类器官的详细方法。

摘要

胃患者来源的类器官 （PDO） 为研究胃生物学和病理学提供了一种独特的工具。因此，这些 PDO 在广泛的研究应用中得到越来越多的应用。然而，在保持标准化初始细胞接种密度的同时，从单细胞消化物中生产胃 PDO 的已发表方法存在短缺。在该协议中，重点是从分离的单细胞中启动胃类器官，并提供一种通过片段传代类器官的方法。重要的是，该方案表明，初始细胞接种密度的标准化方法始终如一地从良性活检组织中产生胃类器官，并允许类器官生长的标准化定量。最后，证据支持新的观察结果，即胃PDOs显示出不同的形成和生长速率，这取决于类器官是来自身体的活检还是胃的窦区。具体来说，与胃体活检产生的类器官相比，使用窦活检组织进行类器官启动会导致在 20 天内形成更多的类器官和更快的类器官生长。本文描述的方案为研究人员提供了一种及时且可重复的方法，用于成功生成和使用胃 PDO。

引言

类器官是微型三维 （3D） 细胞结构，类似于它们衍生的器官的结构和功能 ^1,2。这些实验室培养的模型是通过在受控环境中培养干细胞或组织特异性细胞而创建的，该环境允许这些细胞自组织并分化成各种细胞类型^1,2,3。类器官的主要优势之一是它们能够比传统的二维 （2D） 细胞培养物更接近地概括人类生物学 ^1,2,3。特别是，人类类器官已被证明可以维持其起源组织的遗传多样性^3,4,5。类器官提供了一个独特的机会，可以在受控的实验室环境中研究人体器官发育、模拟疾病和测试潜在的治疗方法。此外，类器官可以从个体患者样本中衍生出来，从而实现个性化医疗方法和个性化治疗的潜在发展^3,6,7

研究方案

本协议中使用的所有人体组织都是从通过宾夕法尼亚大学机构审查委员会 （IRB #842961） 批准的胃组织收集研究提供组织收集知情同意的个人收集的。作为常规护理的一部分，本研究的参与者被要求接受上消化道内窥镜检查，至少年满 18 岁，并能够提供知情同意。所有研究均遵循宾夕法尼亚大学制定的指导方针。

1.实验准备

1. 如前所述制备有条件的L-WRN培养基¹⁶。虽然不是强制性的，但可以按照制造商的说明使用市售的 ELISA 试剂盒检查条件培养基中所含的 Wnt-3A、R-spondin 和 noggin 的浓度（参见 材料表）。
2. 制备RPMI-抗生素（RPMI-ABX），PBS-抗生素（PBS-ABX），PBS-二硫苏糖醇（PBS-DTT），消化缓冲液和胃类器官培养基（详细组成见 补充表1 ）。胃类器官培养基在4°C下稳定1周。
3. 高压灭菌镊、细解剖剪刀和 1.5 mL 管。
4. 开始在冰上解冻基底膜基质（基质胶）。
5. 开始在37°C水浴中解冻消化缓冲液和胰蛋白酶-EDTA。
6. 将培养箱轨道振荡器设置为37°C和200rpm。

2. 从活检组织中分离....

讨论

本文概述了从胃体和胃窦的良性上皮活检中分离出的单细胞可靠地产生人胃类器官的详细方案。该协议中的关键步骤围绕着定时以及处理基底膜基质。为了保持活力，必须在获得活检组织后尽快启动方案。目的是在进行活检后 30 分钟内开始消化活检组织。处理基底膜基质也可能具有挑战性。在冰上解冻时，它仍然是液体;然而，在高于4°C的温度下，它会聚合。因此，必须立即将基底膜基质从冰中?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R&D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Amphotericin B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Dithiothreitol (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamicin	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazole	MP Biomedicals	155710
N2 Supplement	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen Strep	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA Kit	R&D Systems	DY4120-05
Wnt-3a ELISA Kit	R&D Systems	DY1324B-05
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503