通过纳秒脉冲电场调节雪旺细胞生长以促进体外周围神经再生

摘要

在这里，我们提出了一种应用纳秒脉冲电场（nsPEF）在 体外刺激雪旺细胞的方案。相关因子的合成和分泌能力以及细胞行为变化验证了nsPEF刺激的成功性。该研究对周围神经再生方法给出了积极的看法。

摘要

雪旺细胞 （SC） 是周围神经系统的髓鞘化细胞，在周围神经再生中起着至关重要的作用。纳秒脉冲电场 （nsPEF） 是一种适用于神经电刺激的新兴方法，已被证明可有效刺激细胞增殖和其他生物过程。为了评估 SC 在 nsPEF 下是否发生显着变化并帮助探索新的周围神经再生方法的潜力，将培养的 RSC96 细胞在 5 kV 和 10 kV 下进行 nsPEF 刺激，然后继续培养 3-4 天。随后，评估了SCs表达的一些相关因子，以证明刺激成功，包括特异性标记蛋白、神经营养因子、转录因子和髓鞘形成调节因子。代表性结果表明，nsPEF显著增强了SCs的增殖和迁移，并增强了合成对周围神经再生有积极贡献的相关因子的能力。同时，GFAP表达较低提示周围神经损伤的良性预后。所有这些结果表明，nsPEF作为一种有效的治疗方法，通过刺激SCs治疗周围神经损伤具有巨大的潜力。

引言

每年有数百万人受到涉及周围神经系统 （PNS） 和中枢神经系统 （CNS） 的神经损伤的影响¹。研究表明，神经损伤后中枢神经系统的轴突修复能力相当有限，而 PNS 由于 SCs² 的显着可塑性而显示出增强的能力。然而，在周围神经损伤后实现完全再生仍然艰巨，并继续对人类健康构成重大挑战 ^3,4。如今，尽管存在供体部位发病率高和可用性有限的缺点，但自体移植物仍然是一种常见的治疗方法⁵.这种情况促使研究人员探索替代疗法，包括材料⁶、分子因子⁷ 和电刺激 （ES）。作为促进轴突生长和神经再生的一个因素⁸，选择合适的 ES 方法并探索 ES 和 SCs 之间的关系变得至关重要。

SCs 是 PNS 的主要神经胶质细胞，在 PNS ^9,10 的再生中起着至关重要的作用。周围神经损伤后，SC 经历快速激活、广泛的重编程²，并从髓....

研究方案

1. 冻存 RSC96 细胞的解冻

1. 通过在37°C水浴中快速摇动解冻含有1mL细胞悬液的冻存管，然后将其加入含有4-6mL完全培养基的离心管中并充分混合。
2. 以1000× g 离心3-5分钟，弃去上清液并将细胞重悬于3mL完全培养基中。
3. 将细胞悬浮液加入含有6-8mL完全培养基的培养瓶（或培养皿）中，并在37°C下孵育过夜。
4. 第二天，在显微镜下观察细胞生长和密度。

2.细胞传代：

注意：如果细胞密度达到80%-90%，则准备传代。

1. 丢弃培养基，用不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗细胞 1-2 次。
2. 向培养瓶中加入0.25%（w / v）胰蛋白酶-0.53mM EDTA（T25烧瓶为1-2mL，T75烧瓶为2-3mL），并在37°C下孵育1-2分钟。
3. 在显微镜下观察细胞脱离。如果大多数细胞变圆并脱落，请迅速将烧瓶放回工作区域，轻轻敲击烧瓶，然后加入 3-4 mL 含有 10% FBS 的培养基以停止消化。
4. 混合内容物，吸出溶液，并以1000× g 离心5分钟。然后，丢弃上清液并通过加入 1-2 mL 新鲜培养基并轻轻移液来重悬细胞。

讨论

据报道，近年来，nsPEF的应用经历了推动增长。nsPEF 仅对所需区域具有高度针对性的影响，提供足够的能量进行治疗而不会造成额外的热损伤，使其对人体更安全²⁸.这些特性使其在肿瘤治疗和神经再生方面具有广阔的转化前景。然而，一些研究提出了nsPEF的一些局限性。与材料研究相比，ES受到外部电源和电线²⁹的约束。此外，最近的一项研究证明，围手术期使?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mounting medium	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1401
Anti-GFAP Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB12100-100
Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB12144-100
Anti-S100 beta Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB14146-100
BSA	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GC305010
Coverslip	Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD	10212432C
CY3-labeled goat anti-mouse IgG	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB21302
DAPI Staining Reagent	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1012
Decolorizing shaker	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	DS-2S100
High Voltage Power Supply for nsPEF	Matsusada Precision Inc.	AU-60P1.6-L
Histochemical pen	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G6100
Membrane breaking liquid	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1204
Microscope slide	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G6012
Palm centrifuge	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	MS6000
PBS powdered	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G0002
Pipette	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
Positive fluorescence microscope	Nikon, Japan	NIKON ECLIPSE C1
Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibody	Beijing Bioss Biotechnology Co., LTD	BS-20563R-AF488
RSC96 Schwann cells	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	STCC30007G-1
scanister	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
Special cable for nsPEF	Times Microwave Systems	M17/78-RG217
Turbine mixer	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	MV-100