通过纳秒脉冲电场调节雪旺细胞生长以促进体外周围神经再生

摘要

在这里，我们提出了一种应用纳秒脉冲电场（nsPEF）在 体外刺激雪旺细胞的方案。相关因子的合成和分泌能力以及细胞行为变化验证了nsPEF刺激的成功性。该研究对周围神经再生方法给出了积极的看法。

摘要

雪旺细胞 （SC） 是周围神经系统的髓鞘化细胞，在周围神经再生中起着至关重要的作用。纳秒脉冲电场 （nsPEF） 是一种适用于神经电刺激的新兴方法，已被证明可有效刺激细胞增殖和其他生物过程。为了评估 SC 在 nsPEF 下是否发生显着变化并帮助探索新的周围神经再生方法的潜力，将培养的 RSC96 细胞在 5 kV 和 10 kV 下进行 nsPEF 刺激，然后继续培养 3-4 天。随后，评估了SCs表达的一些相关因子，以证明刺激成功，包括特异性标记蛋白、神经营养因子、转录因子和髓鞘形成调节因子。代表性结果表明，nsPEF显著增强了SCs的增殖和迁移，并增强了合成对周围神经再生有积极贡献的相关因子的能力。同时，GFAP表达较低提示周围神经损伤的良性预后。所有这些结果表明，nsPEF作为一种有效的治疗方法，通过刺激SCs治疗周围神经损伤具有巨大的潜力。

引言

每年有数百万人受到涉及周围神经系统 （PNS） 和中枢神经系统 （CNS） 的神经损伤的影响¹。研究表明，神经损伤后中枢神经系统的轴突修复能力相当有限，而 PNS 由于 SCs² 的显着可塑性而显示出增强的能力。然而，在周围神经损伤后实现完全再生仍然艰巨，并继续对人类健康构成重大挑战 ^3,4。如今，尽管存在供体部位发病率高和可用性有限的缺点，但自体移植物仍然是一种常见的治疗方法⁵.这种情况促使研究人员探索替代疗法，包括材料⁶、分子因子⁷ 和电刺激 （ES）。作为促进轴突生长和神经再生的一个因素⁸，选择合适的 ES 方法并探索 ES 和 SCs 之间的关系变得至关重要。

SCs 是 PNS 的主要神经胶质细胞，在 PNS ^9,10 的再生中起着至关重要的作用。周围神经损伤后，SC 经历快速激活、广泛的重编程²，并从髓鞘形成状态过渡到生长支持形态以进行神经再生²。SC 的大量增殖发生在损伤神经的远端，而远端残端的 SC 经历增殖和伸长以形成 Bungner 带，这是引导轴突向靶器官生长所必需的¹¹。此外，来自近端和远端神经残端的 SC 迁移到神经桥中形成 SC 索，促进轴突再生¹²。此外，先前的研究表明，在周围神经再生的情况下，与SCs相关的因子的合成和分泌会发生变化，包括转录因子¹³、神经营养因子¹⁴和髓鞘形成调节因子¹³。基于这些，促进SC增殖、迁移、合成和相关因子的分泌，在改善周围神经再生方面已被广泛研究¹⁵。

先前的研究表明了使用 ES 进行神经再生的可能性¹。一个被广泛接受的解释是，ES 可以通过改变这些生物分子上的电荷分布来诱导细胞膜的去极化，改变膜电位并影响膜蛋白的功能¹。然而，广泛应用的强烈 PEF 可能会导致剧烈疼痛、不自主肌肉收缩和心脏颤动⁸.它还会增加肌酸激酶 （CK） 活性，降低肌肉力量，并诱导迟发性肌肉酸痛 （DOMS）¹⁶ 的发展。nsPEF 是一种新兴技术，它在纳秒脉冲持续时间内用高压电场刺激测试对象，并逐渐用于细胞水平的研究^17,18。先前的研究表明，nsPEF促进细胞增殖和细胞器活性的可能原理是膜纳米孔的形成和离子通道的激活，这导致细胞质^Ca2+浓度的增加¹⁹。nsPEF 利用脉冲功率技术对细胞膜进行充电，产生的脉冲具有持续时间短、上升时间快、功率高、能量密度低等特点²⁰.这些特征表明，nsPEF 可能是一种首选模式，刺激副作用最小⁸。此外，与手术干预相比，nsPEF 具有微创手术、可逆性、可调节性和对神经组织的非破坏性等优势。nsPEF在生物医学领域的一个主流研究方向是其在利用高能电场刺激进行肿瘤组织消融方面的应用21,22,23。一些研究结果表明，12-nsPEF 可以刺激周围神经而不会造成损伤²⁴.然而，目前，关于nsPEF在神经再生领域的应用证据有限。此外，使用 nsPEF 刺激 SC 是一项开创性的尝试，有助于进一步的体内和临床研究。本研究探讨了nsPEF刺激SCs是否能促进神经再生，为后续的深入系统研究提供可靠依据。

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研究方案

1. 冻存 RSC96 细胞的解冻

1. 通过在37°C水浴中快速摇动解冻含有1mL细胞悬液的冻存管，然后将其加入含有4-6mL完全培养基的离心管中并充分混合。
2. 以1000× g 离心3-5分钟，弃去上清液并将细胞重悬于3mL完全培养基中。
3. 将细胞悬浮液加入含有6-8mL完全培养基的培养瓶（或培养皿）中，并在37°C下孵育过夜。
4. 第二天，在显微镜下观察细胞生长和密度。

2.细胞传代:

注意:如果细胞密度达到80%-90%，则准备传代。

1. 丢弃培养基，用不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗细胞 1-2 次。
2. 向培养瓶中加入0.25%（w / v）胰蛋白酶-0.53mM EDTA（T25烧瓶为1-2mL，T75烧瓶为2-3mL），并在37°C下孵育1-2分钟。
3. 在显微镜下观察细胞脱离。如果大多数细胞变圆并脱落，请迅速将烧瓶放回工作区域，轻轻敲击烧瓶，然后加入 3-4 mL 含有 10% FBS 的培养基以停止消化。
4. 混合内容物，吸出溶液，并以1000× g 离心5分钟。然后，丢弃上清液并通过加入 1-2 mL 新鲜培养基并轻轻移液来重悬细胞。
5. 将细胞悬液以 1:2 的比例转移到新的 T25 烧瓶中，并加入 7 mL 培养基。

3. nsPEF设备的操作

1. 将 RSC96 细胞重悬于 1 mL DMEM 培养基中，并将它们转移到两侧都有电极的比色培养皿中。
2. 打开电源开关。
3. 通过旋转仪器上的旋钮来调整参数以改变电场的强度。本研究中设定的强度为 5 kV/cm、10 kV/cm、20 kV/cm 和 40 kV/cm。
4. 小心地旋转电极，直到出现火花，让电池根据预设的场强强度接收 5 个 nsPEF 脉冲，然后立即分离两个电极。在这种处理之后，取用nsPEF处理的实验组细胞和未处理的对照组细胞，在一定时期的细胞培养（本实验为1天）后分别进行第4-6节。

4. 细胞计数试剂盒-8 （CCK-8） 检测

1. 从用电刺激刺激的 RSC96 细胞中制备特定浓度的细胞悬液。将 100 μL 细胞悬液添加到 96 孔细胞培养板的每个孔中。考虑到 CCK-8 测定的要求，将试剂盒中的细胞总数控制在 1 x 10³ 和 1 x 10⁶ 之间。
2. 从试剂盒中取出 10 μL CCK-8 溶液，并将其添加到 96 孔细胞培养板中。在37°C的CO₂ 培养箱中再孵育30分钟至4小时。
3. 测量吸光度。使用双波长测量，检测波长为 430-490 nm，参考波长为 600-650 nm。
4. 根据细胞增殖的实验结果确定后续实验的场强强度。选择增殖良好的细胞进行后续实验。

5. 细胞划痕测定

1. 在六孔板的每个孔中，接种 3 x 10⁵ 个细胞，每孔总体积为 2 mL。大约72小时后，细胞将覆盖孔。分别对实验组和对照组进行试验。
2. 使用移液器吸头在培养孔的底部画一条水平线。确保移液器吸头垂直握住，并尽量避免倾斜。
3. 吸出培养基并用PBS洗涤2-3次。
4. 向每个孔中加入 2 mL 无血清培养基。
5. 将板置于37°C培养箱中。在0小时和24小时倒置显微镜的四倍放大下拍照，观察细胞迁移的变化。

6. 免疫荧光

1. 细胞通透性:
   1. 轻轻地将细胞悬浮液移液到培养皿中后，用组织学笔在细胞均匀分布在盖玻片上的位置画圆圈。对照组和不同实验组分别治疗。
   2. 加入 50-100 μL 透化工作溶液 （0.25-0.5% Triton X-100），并在室温 （RT） 下孵育 20 分钟。用PBS洗涤3次，每次5分钟。
2. 血清阻断:在圆圈内添加 3% BSA，以均匀覆盖组织。在室温下孵育 30 分钟。
3. 一抗孵育:轻轻去除封闭溶液，并将适当稀释的一抗（小鼠来源，以 1:300 稀释）加入细胞孔中。将细胞培养板置于潮湿的盒子中，并在4°C下孵育过夜。
4. 二抗孵育:将细胞板放在振荡器上，洗涤 3 次，每次 5 分钟。加入相应的二抗（CY3 标记的山羊抗小鼠 IgG，以 1:300 稀释）并在室温下孵育 50 分钟。
5. DAPI核染色:
   1. 将盖玻片放入PBS（pH 7.4）中，放在振荡器上，洗涤3次，每次5分钟。
   2. 轻轻干燥载玻片后，在圆圈内加入DAPI染色溶液（2μg/ mL，每圈0.5mL），并在室温下在暗室中孵育10分钟。
6. 安装:将盖玻片放入PBS（pH 7.4）中，放在振荡器上，洗涤3次，每次5分钟。轻轻干燥载玻片后，用抗褪色封固剂密封盖玻片以获得荧光。
7. 图像采集:在330-380nm的波长处激发DAPI，并在420nm处检测发射;AF488 在 465-495 nm 处激发并检测 515-555 nm 处的发射;在 510-560 nm 处激发，在 590 nm 处检测 CY3 的发射;在 608-648 nm 处激发，并在 672-712 nm 处检测 CY5 的发射。

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结果

低强度脉冲电场刺激细胞增殖
CCK-8实验显示，5 kV/cm组细胞中RSC96的增殖速率明显快于对照组细胞。然而，随着参数的增加（20 kV/cm和40 kV/cm），增殖率不稳定，甚至低于对照组。40 kV/cm组RSC96细胞增殖率明显低于对照组和5 kV/cm组，差异有统计学意义（P < 0.05）。由于不满足细胞增殖的实验要求，在后续实验中排除了20 kV/cm和40 kV/cm组（图1）。

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讨论

据报道，近年来，nsPEF的应用经历了推动增长。nsPEF 仅对所需区域具有高度针对性的影响，提供足够的能量进行治疗而不会造成额外的热损伤，使其对人体更安全²⁸.这些特性使其在肿瘤治疗和神经再生方面具有广阔的转化前景。然而，一些研究提出了nsPEF的一些局限性。与材料研究相比，ES受到外部电源和电线²⁹的约束。此外，最近的一项研究证明，围手术期使?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mounting medium	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1401
Anti-GFAP Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB12100-100
Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB12144-100
Anti-S100 beta Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB14146-100
BSA	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GC305010
Coverslip	Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD	10212432C
CY3-labeled goat anti-mouse IgG	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB21302
DAPI Staining Reagent	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1012
Decolorizing shaker	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	DS-2S100
High Voltage Power Supply for nsPEF	Matsusada Precision Inc.	AU-60P1.6-L
Histochemical pen	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G6100
Membrane breaking liquid	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1204
Microscope slide	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G6012
Palm centrifuge	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	MS6000
PBS powdered	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G0002
Pipette	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
Positive fluorescence microscope	Nikon, Japan	NIKON ECLIPSE C1
Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibody	Beijing Bioss Biotechnology Co., LTD	BS-20563R-AF488
RSC96 Schwann cells	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	STCC30007G-1
scanister	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
Special cable for nsPEF	Times Microwave Systems	M17/78-RG217
Turbine mixer	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	MV-100