便携式纸基免疫测定法与智能手机应用相结合，用于登革热NS1抗原的比色和定量检测

摘要

为了满足登革热的紧急诊断需求，我们在此介绍一种集成了智能手机应用程序的登革热NS1纸质分析设备（DEN-NS1-PAD），用于量化临床血清/血液样本中的登革热NS1抗原浓度。这项创新通过帮助各种医疗机构（甚至是资源有限的医疗机构）的临床决策来加强登革热管理。

摘要

由 伊 蚊传播的登革热病毒（DENV）感染是热带和亚热带国家的主要公共卫生问题。每年约有1000万例病例和20,000-25,000例死亡，特别是在儿童中，迫切需要实用的诊断工具。早期感染期间登革热非结构蛋白 1 （NS1） 的存在与细胞因子释放、血管渗漏和内皮功能障碍有关，使其成为重症登革热的潜在标志物。

基于纸张的免疫测定，如侧向层析测定 （LFA） 和微流体纸质分析设备 （PAD），由于其简单、快速、廉价、特异性和易于解释，作为诊断测试越来越受欢迎。然而，用于登革热 NS1 检测的传统纸质免疫测定通常依赖于目视检查，只能产生定性结果。为了解决这一局限性并提高灵敏度，我们提出了一种高度便携的 NS1 登革热检测方法，即纸质分析设备 （PAD），即 DEN-NS1-PAD，它将智能手机应用程序集成为比色和定量阅读器。该开发系统可直接定量临床样本中的NS1浓度。

利用从患者身上获得的血清和血液样本来证明系统原型的性能。结果立即获得，可用于临床评估，无论是在设备齐全的医疗机构还是资源有限的环境中。这种基于纸张的免疫测定与智能手机应用的创新组合为增强登革热NS1抗原的检测和定量提供了一种很有前途的方法。通过提高肉眼能力之外的灵敏度，该系统在改善登革热管理的临床决策方面具有巨大潜力，特别是在偏远或服务不足的地区。

引言

登革热病毒 （DENV） 感染是传播速度最快的蚊媒疾病¹，全球每年有超过 3.9 亿人感染，有 9600 万例有症状感染，200 万例重症病例，超过 25,000 人死亡 ^1,2。根据世界卫生组织 （WHO） 的数据，估计有 39 亿人面临登革热风险;~70% 居住在亚太国家，主要居住在东南亚³.2019年，向世卫组织报告的登革热病例数为420万例，泰国贡献了至少13.6万例登革热病例和144例登革热感染死亡病例⁴。泰国的登革热疫情发生在4月至12月的雨季，发生在城市和农村地区，特别是在东北部地区。

登革热病毒感染有不同的临床表现，从亚临床症状、轻度登革热 （DF） 到重度登革出血热 （DHF）。严重 DHF 疾病的主要特征是血管通透性增加，其次是休克和器官功能障碍¹。了解可能导致血管渗漏的分子途径对于开发有效的登革热治疗方法非常重要。登革热非结构蛋白 1 （NS1） 是早期病毒感染期间分泌的糖蛋白 ^5,6，^可作为病毒 RNA 复制的辅助因子⁷。NS1 可通过与 toll 样受体 4 （TLR4） 和内皮糖萼 ^8,9 结合来触发细胞因子释放并导致血管渗漏。体外研究表明，NS1与内皮细胞相互作用并诱导细胞凋亡。这种情况会导致内皮功能障碍和血管渗漏¹⁰。与血清白细胞介素 （IL）-10 水平相关的 NS1 抗原水平在重症临床疾病患者中显著升高¹¹。登革热 NS1 还通过诱导 IL-10 和抑制 DENV 特异性 T 细胞反应来促进疾病发病机制^12,13。此外，登革热NS1蛋白与严重临床疾病有关，发病前3天NS1浓度>600 ng mL-1与DHF¹⁴的发生相关。

登革热NS1抗原在DHF患者中的持续存在可作为重症^登革热6的标志物。有几种方法可以检测临床样本中的 NS1，例如酶联免疫吸附测定 （ELISA） 和快速检测¹⁵。在临床环境中测量 NS1 蛋白浓度的金标准是 ELISA 方法。然而，ELISA方法价格昂贵，需要熟练的人员和实验室设施¹⁶。因此，在床旁检测 （POCT） 中检测和定量 NS1 蛋白的技术仍在开发中。在过去十年中，基于纸张的免疫测定，如侧向层析测定（LFAs）和微流体纸质分析设备（μPAD），因其简单、快速、廉价和特异性而成为诊断测试的流行点17,18,19。在基于纸张的免疫测定中，已使用多种标记来生成信号，例如金纳米颗粒 （AuNPs）²⁰、磁性纳米颗粒^21,22、量子点²³ 和荧光材料^24,25。AuNPs是纸质免疫测定中最常用的标记物，因为它们的生产成本低廉、易于制造、稳定性高、读数简单。目前，登革热 NS1 的侧向层析测定 （LFA） 在临床环境中的使用很有名^26,27。然而，传统的LFA标签检测通常使用肉眼，只能提供定性结果。

在过去十年中，全球已有超过50亿部智能手机被广泛使用，并且有可能开发便携式检测^28,29。智能手机具有内置物理传感器、多核处理器、数码相机、USB 端口、音频端口、无线和应用软件等多功能功能，使其适用于各种生物传感器平台³⁰。此外，无线技术允许快速发送数据，并可用于实时和现场监控³¹。Mudanyali 等人将纸质免疫测定和智能手机相结合，开发了一种便携式、无需设备、快速、低成本且用户友好的 POCT 平台，用于疟疾、结核病和 HIV³²。Ling等人报道了一种侧向层析法与智能手机摄像头相结合，可以定量检测牛奶中的碱性磷酸酶活性³³。Hou 等人还开发了一种基于智能手机的双模态成像系统，用于在侧向层析测定中对颜色或荧光发出定量信号³⁴。此外，使用智能手机作为比色和定量阅读器可以提高灵敏度，而肉眼无法自信地报告目标³⁵的存在。

DEN-NS1-PAD 36,37,38（以下简称该设备）在登革热诊断方面取得了突破性进展，提供了一种便携且高效的解决方案。该设备使用蜡印微流控纸技术，通过图像处理以高灵敏度和特异性定量 NS1。为了进一步提高其实用性，我们开发了一款用户友好的智能手机应用程序，用于比色和定量阅读。使用来自泰国医院的患者样本进行临床验证强调了其对实时患者评估的直接影响。我们的创新标志着简化的床旁登革热管理取得了关键性进展，有望彻底改变资源有限的医疗保健领域的诊断。

研究方案

泰国曼谷Phramongkutklao医院泰国皇家陆军医疗部机构审查委员会伦理委员会（IRBRTA 1218/2562）批准了这一计划。在进行这项研究时，我们遵守了所有必要的道德规范。

1. 纸基免疫测定法的设备制造

注：纸质免疫测定装置是按照先前建立的方法^36,37和泰国专利请求号190100816³⁸制造的。

1. 设计和图案绘制：在计算机上设计具有 18 个 PAD 蜡图案的纸质分析设备（图 1A、B）。
   注意：该设计是特定的，适用于 A5 尺寸的纸张。根据用户的要求，PAD的数量与纸张的大小有关。
2. 使用蜡像打印机将设计的图案打印到纤维素纸上（材料表）。
3. 将蜡印纸在实验室烘箱中在150°C下熔化75秒。 随后，将其储存在二氧化硅盒中，直到后续步骤需要为止。
4. 将 0.5 μL 0.025% 聚-L-赖氨酸 （PLL） 涂覆在测试区域和对照区域。在室温（RT）下在二氧化硅盒中孵育2分钟，然后在65°C的烤箱中加热5分钟。
5. 在对照区域施用 0.5 μL 1 μg ^μL-1 山羊抗小鼠 IgG 抗体，在测试区域施用 0.5 μL 1 ^μL-1 捕获抗体。让滴剂在室温下在硅胶盒中干燥30分钟。
6. 将 2 μL 封闭缓冲液涂加在样品区域，3 μL 涂抹在偶联物区域，2 μL 涂抹在检测区域。让液滴在硅胶盒中以室温干燥30分钟。
7. 将 2 μL 金纳米颗粒抗体复合物 （AuNPs-Ab） 溶液涂覆偶联区域，并在室温下在硅胶盒中干燥 30 分钟。

2. 纸质免疫测定法的组装

1. 小心地撕下胶胶背卡背面的保护膜，露出胶粘剂。
2. 将处理过的纤维素纸与粘性塑料背卡对齐，并将两层牢固地压在一起。
   注意： 避免接触亲水区域，以最大程度地降低污染或损坏设备的风险。
3. 涂上塑料薄膜在纸上并将它们压在一起。
4. 使用剪刀从完全组装好的设备片上剪下所需的设备。
5. DEN-NS1-PAD（图1C）现已投入使用。为了长期稳定，请将它们储存在4°C。

3. AuNPs-Ab偶联物的制备

注：AuNPs-Ab 是按照 Prabowo 等人^{之前描述的 36} 制备的。

1. 将 10 μL 1 mg ^mL-1 抗 NS1 抗体在 PBS 中、1 mL 40 nm AuNPs 胶体和 0.1 mL 0.1 M 硼酸盐缓冲液 （pH 8.5） 合并。
2. 将混合物以50rpm旋转60分钟，并在室温下孵育。
3. 在BBS中加入0.1 mL 10 mg ^mL-1 BSA，以50rpm旋转，并在室温下孵育15分钟。
4. 将溶液在20,187× g 和4°C离心30分钟。
5. 小心地移液并将上清液从沉淀的AuNPs-Ab中分离出来。
6. 将AuNPs-Ab重悬于500μLBBS中，并使用超声处理将其分散。
7. 在20,187× g 和4°C下重复离心30分钟。
   注意： 重复分散和离心过程 3 次。
8. 向悬浮液中加入 50 μL 偶联缓冲液，使其准备好应用于偶联区域。

4. 移动应用开发

1. 图像处理和机器学习开发
   1. 通过收集 900 多张 DEN-NS1-PAD 的自动对焦图像，捕获各种条件，例如不同的浓度、相机品牌（12-13 百万像素）、旋转（90° 和 180°）和照明设置，为监督图像模型收集数据集。在每种特定条件下拍摄 30 张图像 。
   2. 通过识别和注释两个感兴趣区域作为所收集图像中的测试和控制区域来标记基本事实，以进行监督学习。
   3. 设计一种算法来识别背景条带。定位测试区域和对照区域之间的中心线，计算其中点，并在保持相同旋转方向的同时建立与两个主要区域的平均大小成比例的方形区域。
   4. 使用步骤 4.1.1 和 4.1.2 中的数据集和地面实况标签创建图像分割模型，以训练图像分割模型以识别感兴趣区域。
2. 应用算法
   1. 将经过训练的图像分割模型应用于新图像，以自动定位测试区域、控制区域和背景区域。
   2. 使用基本的图像处理技术获取三个感兴趣区域（测试、控制和背景）中每个区域的单个强度值。
   3. 将图像转换为 3D 数组表示（y、x 通道）以访问像素值。
   4. 通过平均 RGB 值将图像转换为灰度，并使用公式 （255-x） 应用反转。
   5. 通过减去背景区域值来规范化测试和控制区域的值。
   6. 使用预先建立的校准曲线计算 NS1 的浓度。
   7. 根据归一化灰度强度³⁷ 得出的截止值 0.1103，将结果分类为正或负。

5. 校准曲线和灵敏度

1. 在人血清中制备 NS1 样品，以浓度为 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 μg ^mL-1 进行校准。
2. 将每种浓度的 50 μL 滴入样品区域并一式三份进行测量。
3. 让样品完全吸入设备，可能需要 20-30 分钟才能获得结果。
4. 孵育 5 分钟后使用数码相机或智能手机拍摄设备的图像。
5. 使用 ImageJ 和自定义移动应用程序分析测试和控制区域。
6. 根据来自 ImageJ 和移动应用程序的数据构建校准曲线。
7. 使用下面的公式 （1-3） 计算空白限 （LOB）、检测限 （LOD） 和定量限 （LOQ）：
   LOB = 空白数据的平均值 + 1：645* ð（空白数据的标准差） （1）
   LOD = LOB +1：645*ð（最低浓度数据的标准偏差） （2）
   LOQ = 空白数据的平均值 + 10*ð（空白数据的标准差） （3）

6. 对临床样本进行纸质免疫测定

1. 在住院第一天收集 300 μL 患者的外周血并将其处理到紫色顶部的 EDTA 管中，遵循良好的临床实践。
2. 将血液在2,884× g 和4°C离心20分钟。
3. 使用移液管将液体成分（等离子体）转移到干净的聚丙烯管中。
4. 将血浆立即储存在-20°C的冰箱中，以便后续分析。
5. 将 20 μL 等离子体涂抹在设备顶部的样品区域。然后，加入 30 μL 洗涤缓冲液（0.05% v/v Tween 20 在 1x 磷酸盐缓冲盐水中）。
6. 让样品完全芯吸到设备中，这可能需要 20-30 分钟才能获得结果。
7. 在室温下孵育 5 分钟后，使用数码相机或智能手机捕获设备的图像。
8. 使用 ImageJ 和自定义移动应用程序分析测试和控制区域。

7. 使用移动应用程序进行定量

注意：在移动应用程序中分析纸质免疫测定的强度（图2）。

1. 在智能手机上打开开发的移动应用程序。
2. 选择 “使用相机 ”或 “从图库上传 ”以选择或上传数据源。通过相机捕获或从设备图库中选择图像来执行此操作。
3. 导航到分析部分，然后触摸屏幕上的 “分析 ”按钮。
4. 等待应用程序分析数据并显示结果。

结果

选择制造方法对于确保纸质免疫测定设备中可重复的测定性能至关重要。在我们的研究中，我们在展示基于纸张的免疫测定的背景下探索了各种制造工艺和材料。我们选择的方法利用蜡印系统在纸基微流控设备中产生疏水屏障。这种方法因其简单、快速和一致的结果而脱颖而出。值得注意的是，它具有避免使用光刻胶化学品的优点，因为光刻胶化学品有可能干扰蛋白质吸附并增加纤维素纸的疏水?...

讨论

基于智能手机的阅读器系统的重要设计参数之一是能够对样品进行可重复的成像处理。在这项研究中，为了简单和方便起见，这些图像是从三个不同的智能手机品牌拍摄的，配备 12-13 MP 摄像头，而无需使用成像盒或配件。图像采集的可变条件（例如相机的分辨率、图像捕获时间、照明条件和环境）可能会影响设备上测试和控制点的颜色强度。通过使用归一化信号强度，将不同图像捕获时间对PAD照...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2)
BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein			the conjugate area treatment and blocking buffer
Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA			the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody
Boric acid	Merck	10043-35-3
Bovine serum albumin fraction V (BSA)	PAA Lab GmbH (Germany)	K41-001
Casein	Merck	9005-46-3
Chromatography paper Grade 2	GE Healthcare	3002-911
Clear laminate film	3M (Stationery shops)
Disodium hydrogen phosphate	Merck	7558-79-4
Double tape side	Stationery shops
Goat anti-mouse IgG antibody	MyBiosource (USA)	MBS435013
Gold nanoparticles (40 nm)	Serve Science Co., Ltd. (Thailand)
Human IgG polyclonal antibody	Merck	AG711-M
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody	MyBiosource (USA)	MBS834415
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody	MyBiosource (USA)	MBS834236
NS1 serotype 2 antigens	MyBiosource (USA)	MBS 568697
PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t			elution buffer
Plastic backing card 10x30 cm	Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand)
Poly-L-lysine (PLL)	Sigma Aldrich	P4832
Potassium Chloride	Merck	104936
Potassium monophosphate	Merck	104877
Sodium Chloride	Merck	7647-14-5
Sodium tetraborate	Sigma Aldrich	1303-96-4
Sucrose	Merck	57-50-1
Tween 20	Sigma Aldrich	9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 multimode reader	BioTek
Mobile phones	Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
Photo scanner	Epson Perfection V30
Oven	Memmert
Wax printer	Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Object Detection documentation	Google Cloud
ImageJ	National Institute of Health, Bethesda, MD, USA
Inkscape 0.91 Software