肠神经系统谱系与人多能干细胞的分化

摘要

从人类多能干细胞 （hPSC） 中提取肠道神经系统 （ENS） 谱系为研究 ENS 发展和疾病以及用于再生医学提供了可扩展的细胞来源。在这里，提出了使用化学定义的培养条件从 hPSC 获得肠道神经元的详细 体外 方案。

摘要

人类肠道神经系统 （ENS） 是一个由神经胶质和神经元细胞类型组成的大型网络，具有显著的神经递质多样性。ENS 控制肠道蠕动、酶分泌和营养吸收，并与免疫系统和肠道微生物组相互作用。因此，ENS 的发育和获得性缺陷是导致许多人类疾病的原因，并可能导致帕金森病的症状。动物模型系统和对原代组织的访问的限制对人类 ENS 的研究构成了重大的实验挑战。在这里，提出了一个详细的方案，用于使用确定的培养条件从人多能干细胞 hPSC 中有效 体外衍生 ENS 谱系。我们的方案从 hPSC 在 15 天内定向分化为肠神经嵴细胞开始，并在 30 天内产生多种功能性肠道神经元亚型。该平台为发育研究、疾病建模、药物发现和再生应用提供了可扩展的资源。

引言

肠神经系统 （ENS） 是周围神经系统中最大的组成部分。ENS 包含超过 4 亿个神经元，这些神经元位于胃肠道内，几乎控制着肠道的所有功能¹。对肠道神经病中 ENS 发育和功能及其缺陷的分子理解需要获得可靠和真实的肠道神经元来源。对人体原代组织的访问是有限的，动物模型无法概括许多肠道神经病中的关键疾病表型。事实证明，人类多能干细胞 （hPSC） 技术在提供所需细胞类型的无限来源方面非常有益，尤其是那些难以从主要来源中分离的细胞类型 2,3,4,5,6,7。在这里，我们提供了从 hPSC 获得 ENS 培养物的逐步和稳健的体外方法的详细信息。这些可扩展的 hPSC 衍生培养物为发育研究、疾病建模和高通量药物筛选开辟了途径，并且可以为再生医学提供可移植细胞。

肠道神经元谱系来源于胚胎发生过程中遵循 ENS 发育路径的神经嵴 （NC） 细胞。在胚胎中，NC 细胞沿着折叠神经板的边缘出现。它们增殖、迁移并产生许多不同的细胞类型，....

研究方案

1. 培养基制备

注意：整个方案中提到的浓度是培养基成分的最终浓度。在无菌条件下在层流罩中准备所有培养基，并在 4 °C 下避光储存。2 周内用完。

1. hPSC 维持培养基：将无饲养层的 hPSC 维持培养基补充剂 （20 μL/mL） 与其基础培养基混合。
2. 培养基 A：将骨形态发生蛋白 4 （BMP4;1 ng/mL）、SB431542 （10 μM） 和 CHIR99021 （600 nM） 添加到分化基础培养基中。
3. 培养基 B：向分化基础培养基中加入 SB431542 （10 μM） 和 CHIR99021 （1.5 μM）。
4. 培养基 C：向分化基础培养基中加入 SB431542 （10 μM）、CHIR99021 （1.5 μM） 和 RA （1 μM）。
5. 神经嵴完全 （NCC） 培养基：向神经基础培养基中加入 FGF2 （10 ng/mL）、CHIR99021 （3 μM）、N2 添加剂 （10 μL/mL）、B27 添加剂 （20 μL/mL）、L-谷氨酰胺添加剂 （10 μL/mL） 和 MEM NEAA （10 μL/mL）。
6. ENC 培养基：向神经基础培养基中加入 GDNF （10 ng/mL）、抗坏血酸 （100 μM）、N2 添加剂 （10 μL/mL）、B27 添加剂 （20 μL/mL）、L-谷氨酰胺....

讨论

此处描述的分化方案提供了一种强大的体外方法，可在 30-40 天内从 hPSC 获得肠道神经元（图 1E）和在较老的培养物中表达神经胶质纤维酸性蛋白、GFAP 和 SOX10 的肠胶质细胞（>第 55 天）^{13、14、19、22}。这些神经元和神经胶质细胞是通过 hPSC 逐步分化为迷走神经和肠神经嵴?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A)	Gibco	12587-010
Basement membrane matrix, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R&D systems	314-BP
Cell culture centrifuge	Eppendorf, model no. 5810R	02262501
Cell detachment solution, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Conical tubes	USA scientific	1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6	Life Technologies	A1516401
DMEM/F-12 no glutamine	Life Technologies	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit	Life Technologies	A2858501
FGF2	R&D systems	233-FB/CF
Fibronectin	Corning	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESC	WiCell	RRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
Inverted microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Laminar flow hood	Thermo Fisher Scientific	1300 series class II, type A2
Laminin	Cultrex	3400-010
L-glutamine supplement, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
Multiwell plates, Falcon	BD	353934, 353075
N-2 Supplement	CTS	A1370701
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
PBS (Ca and Mg free)	Life Technologies	10010023
Pipette filler	Eppendorf	Z768715-1EA
Pipette tips	USA scientific	1111-2830
Pipettes	Fisherbrand	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi	ibidi	81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
SB431542	R&D systems	1614
Trypan blue stain, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Ultra-low attachment plates	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 dihydrochloride	R&D systems	1254