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本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 代表性结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在这里，我们提出了一种方案，通过在 C57BL/6J 小鼠中经颅电凝建立远端大脑中动脉闭塞 （dMCAO） 模型，并评估随后的神经行为和组织病理学特征。

摘要

缺血性中风仍然是全球成年人群死亡和功能障碍的主要原因。只有少数缺血性卒中患者有资格在最佳时间窗口内接受血管内溶栓或机械血栓切除术治疗。在这些中风幸存者中，约有三分之二的人在很长一段时间内患有神经功能障碍。建立稳定且可重复的实验性缺血性脑卒中模型，对于进一步研究缺血性脑卒中的病理生理机制和开发有效的治疗策略具有极其重要的意义。大脑中动脉 （MCA） 是人类缺血性中风的主要部位，MCA 闭塞是局灶性脑缺血的常用模型。在该协议中，我们描述了通过在 C57BL/6 小鼠中经颅电凝建立远端 MCA 闭塞 （dMCAO） 模型的方法。由于闭塞部位位于 MCA 的皮质分支，因此该模型会产生局限于皮层的中度梗死病变。在该模型中，神经行为学和组织病理学特征表明可见的运动功能障碍、神经元变性以及小胶质细胞和星形胶质细胞的明显激活。因此，这种 dMCAO 小鼠模型为研究缺血中风和普及价值提供了有价值的工具。

引言

中风是一种常见的急性脑血管疾病，其特征是残疾和死亡率高1。在所有中风病例中，近 80% 属于缺血性中风2。到目前为止，静脉溶栓仍然是治疗急性缺血性卒中的少数有效方法之一。然而，溶栓治疗的有效性受到有效时间窗窄和出血转化发生的限制3。在缺血性中风后的长期康复阶段，相当多的患者可能会出现持久的神经功能障碍4。迫切需要进一步研究以揭示缺血性中风的潜在病理生理机制，并促进针对缺血性中风的新型治疗策略的开发。建立可靠且可复制的缺血性中风模型对于缺血性中风领域的基础研究以及随后的转化研究至关重要。

1981 年，Tamura 等人通过在大脑中动脉 （MCA） 近端部位采用经颅电凝术开发了局灶性脑缺血模型5。从那时起，许多研究人员利用各种方法，如结扎、压迫或夹闭来诱导远端 MCA 闭塞 （dMCAO），以建立短暂性或永久性缺血性卒中模型 6,7,8。与细丝模型相比，dMCAO 模型表现出明显的优势，例如更小的梗死面积和更高的生存率，使其更适合研究缺血性中风后的长期功能恢....

研究方案

该实验方案由江汉大学机构动物护理和使用委员会批准，并按照中国疾病预防控制中心发布的实验动物伦理指南进行。该方案使用成年雄性 C57BL/6J 小鼠，10 周龄，体重 24-26 g。将所有小鼠饲养在 12 小时的光照/黑暗循环受控环境中，随意进食和水 。

1. 术前准备

注意：该协议所需的关键仪器和设备如图 1 所示。

  1. 手术前，通过高压灭菌对手术器械进行消毒。
  2. 手术前 60 分钟以 5 mg/kg 的剂量皮下注射美洛昔康用于镇痛。
  3. 在诱导室中用 5% 异氟醚麻醉小鼠。
  4. 用 75% 乙醇擦拭加热手术板，并激活加热开关，温度设置为 37 °C。 然后，将鼠标放置在板上的左侧位置，使头部远离外科医生，尾部面向外科医生。
  5. 将面罩贴在小鼠脸上，提供 2% 异氟醚和 0.3 L/min 氧气的恒定供应，用于维持麻醉。将眼膏涂抹在角膜上，以防止它们在手术过程中干燥。
  6. 用剃须刀剃掉从左眼眶到左耳道的毛发。使用脱毛霜去除剩余的皮毛进行消毒。
  7. 通过涂抹聚维酮碘消毒剂和 75% 乙醇 3 次来准备手术区域。

2. 远....

代表性结果

用于执行 dMCAO 的关键器械是显微外科器械组、异氟醚蒸发器和单极显微外科电凝发生器， 如图 1 所示。本研究的实验过程如图 2 所示。简而言之，采用小骨窗开颅手术暴露远端 MCA，随后凝固以诱导 C57BL/6 小鼠永久性局灶性脑缺血。此外，在 dMCAO 后 3 天通过 TTC 染色、组织学检查和行为评估评估缺血性损伤和卒中结局。在手术过程中，只有 1 只小鼠死?.......

讨论

在目前的开颅电凝 dMCAO 模型方案中，外科手术以最小的侵入性进行，其中仅分离一部分颞肌以减轻对咀嚼功能的不利影响。小鼠在手术后都恢复得很好，没有观察到喂养困难的情况。MCA 可以在小鼠的颞骨中轻松辨别，从而有助于精确识别合适的开颅手术位置。这种 dMCAO 模型诱导的缺血性病变位于皮层的外侧部分，与 Llovera G 等人描述的先前报告一致13。此外，与该模型相关的梗.......

披露声明

作者没有利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到湖北省自然科学基金资助 （2022CFC057）。

....

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
2,3,5-Triphenyltetrazolium
Chloride (TTC)		Sigma-Aldrich108380Dye for TTC staining
24-well culture plateCorning (USA)CLS3527Vessel for TTC staining
4% paraformaldehydeWuhan Servicebio Technology
Co., Ltd.		G1101Tissue fixation
5% bovine serum albuminWuhan BOSTER Bio Co., Ltd.AR004Non-specific antigen blocking
5-0 Polyglycolic acid sutureJinhuan Medical Co., LtdKCR531Material for surgery
Anesthesia machineMidmark CorporationVMRAnesthetized animal
Antifade mounting mediumBeyotime BiotechP0131Seal for IF staining
Automation-tissue-dehydrating 
machine		Leica Biosystems (Germany)TP1020Dehydrate tissue
Depilatory creamVeet (France)20220328Material for surgery
Diclofenac sodium gelWuhan Ma Yinglong Pharmaceutical
 Co., Ltd.		H10950214Analgesia for animal
Drill tip (0.8 mm)Rwd Life Science Co., Ltd.Equipment for surgery
Eosin staining solutionWuhan Servicebio Technology
Co., Ltd.		G1001Dye for H&E staining
Eye ointmentGuangzhou Pharmaceutical Co., LtdH44023098Material for surgery
Fluorescence microscopeOlympus (Japan)BX51Image acquisition
GFAP Mouse monoclonal antibodyCell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, USA)		3670Primary antibody for IF staining
Goat anti-mouse Alexa
488-conjugated IgG		Cell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, USA)		4408Second antibody for IF staining
Goat anti-rabbit Alexa
594-conjugated IgG		Cell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, USA)		8889Second antibody for IF staining
Grip strength meterShanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.XR501Equipment for behavioral test
Hematoxylin staining solutionWuhan Servicebio Technology
Co., Ltd.		G1004Dye for H&E staining
Iba1 Rabbit monoclonal antibodyAbcamab178846Primary antibody for IF staining
IsofluraneRwd Life Science Co., Ltd.R510-22-10Anesthetized animal
Laser doppler blood flow meterMoor Instruments (UK)moorVMSBlood flow monitoring
MeloxicamBoehringer-IngelheimJ20160020Analgesia for animal
MicrodrillRwd Life Science Co., Ltd.78001Equipment for surgery
Microsurgical instruments setRwd Life Science Co., Ltd.SP0009-REquipment for surgery
MicrotomeThermo Fisher Scientific (USA)HM325Tissue section production
Microtome bladeLeica Biosystems (Germany)819Tissue section production
Monopolar electrocoagulation generatorSpring Scenery Medical Instrument
Co., Ltd.		CZ0001Equipment for surgery
Mupirocin ointmentTianjin Smith Kline & French
Laboratories Ltd.		H10930064Anti-infection for animal
NeuN Rabbit monoclonal antibodyCell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, USA)		24307Primary antibody for IF staining
Neutral balsamAbsin Bioscienceabs9177Seal for H&E staining
Paraffin embedding centerThermo Fisher Scientific (USA)EC 350Produce paraffin blocks
Pentobarbital sodiumSigma-AldrichP3761Euthanized animal
Phosphate buffered salineShanghai Beyotime Biotech Co., LtdC0221ARinsing for tissue section
ShaverShenzhen Codos Electrical Appliances
Co.,Ltd.		CP-9200Equipment for surgery
Sodium citrate solutionShanghai Beyotime Biotech Co., Ltd.P0083Antigen retrieval for IF staining

参考文献

  1. Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. Hyperacute management of ischemic strokes: JACC Focus Seminar. J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).
  2. GBD 2016 Stroke Collaborators.

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