从成人成纤维细胞中生产心脏细胞外基质，用于培养皿包被

摘要

从成人心脏中分离的成纤维细胞培养至在明胶包被的培养皿上汇合，以产生心肌特异性细胞外基质。脱细胞后，该底物可用于培养和研究其他心肌细胞和细胞-基质相互作用。

摘要

心肌由心肌细胞和更多的成纤维细胞组成，后者负责细胞外基质的产生。从心脏发育的早期阶段到一生，在正常和病理条件下，细胞外基质的组成都会发生变化并影响心肌的结构和功能。此处描述的方法的目的是获得体外培养 心肌细胞的 底物（称为心脏 ECM），模拟 体内心肌细胞外基质。为此，从成人心脏中分离的成纤维细胞被培养到明胶包被的培养皿上汇合，以产生心肌特异性细胞外基质。随后去除心脏成纤维细胞，同时保留沉积的心脏 ECM，为研究心肌特异性细胞外基质对其他细胞的影响产生了底物。重要的是，培养皿的成纤维细胞衍生涂层的组成根据从心脏分离的成纤维细胞的 体内 活性而变化，从而允许后续研究不同正常和病理条件下的细胞-基质相互作用。

引言

所有细胞在体内都位于专门的微环境中，它们可以在其中生存并执行其特定功能。在任何给定的组织中，细胞都被细胞外基质包围，该基质由纤维蛋白和非纤维蛋白以及富含糖胺聚糖的基本物质组成¹。基质含量的定性和定量变化影响细胞生物学，控制细胞增殖、凋亡、迁移或分化等过程。因此，人们投入精力重建这种微环境，用于来自不同组织细胞的体外研究 ^2,3。

心肌由心肌细胞和大量成纤维细胞组成，它们在产生和维持心肌内的细胞外基质中起关键作用⁴。在整个生命过程中，细胞外基质的组成会响应各种正常和病理因素而发生变化。细胞外基质组成的这些修饰对心肌的结构和生物力学特性有重大影响⁵。因此，如果在体外复制特定于不同年龄或病理状况的微环境，则应该有利于理解人心肌内的细胞-基质相互作用 ^6,7。

此处描述的方法旨在获得体外培养 心肌细胞的 底物（称为心脏....

研究方案

心脏组织取自正在接受心脏移植的缺血性心脏病引起的终末期心力衰竭患者。用于实验的所有标本均在患者同意的情况下收集，没有患者标识符，遵循那不勒斯费德里科二世大学伦理委员会批准的方案，并符合赫尔辛基宣言中概述的原则。材料 表中列出了用于研究的所有试剂和设备的详细信息。

1. 实验准备

1. 准备无菌工具/仪器：一把大手术剪刀、两套细镊子、两对显微解剖剪刀、1 L 无菌瓶、500 mL 无菌瓶和一个 250 mL 无菌瓶。
2. 用 70% 乙醇对 22 mm x 22 mm 的盖玻片进行消毒几秒钟。使用 10 mL 血清移液管吸出乙醇，让盖玻片在 37 °C 的烘箱中干燥，并在高压灭菌器中消毒。
3. 将市售的盐粉溶解在无菌双蒸水中。在 1 L 无菌瓶中，加入 0.35 g 碳酸氢钠粉末，制备 1 L pH 值为 7.4 的 Hank 平衡盐溶液 （HBSS）。在无菌罩下使用 0.22 μm 滤膜对溶液进行消毒，并在 4 °C 下储存直至使用。
4. 称取 0.1 g 磷酸二氢钾、4.0 g 氯化钠、0.1 g 氯化钾和 0.575 g 磷酸氢二钠，制备 500 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。将组分溶解在无菌双蒸水中，然后检查 pH 值 （7.4）。过滤在无菌罩下灭菌，并在 4 °C....

讨论

从人心脏样本中分离的成纤维细胞培养至汇合 21 天，以合成和沉积细胞外基质，形成牢固粘附在培养板表面的粘性层。随后去除心脏成纤维细胞，同时保留沉积的心脏 ECM，为研究心肌特异性细胞外基质对心脏组织内其他细胞的影响产生了底物。

使用天然和组织特异性底物进行体外细胞培养的概念引起了生物学家的兴趣，导致多次尝试使用从新生动?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L laboratory bottle	VWR	215-1595	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate	VWR	391-0578	Clean and autoclave before use
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses	VWR	631-1570	Autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle	VWR	215-1593	Clean and autoclave before use
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle	VWR	215-1594	Clean and autoclave before use
60 mm plates	Falcon	353004	Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH)	Sigma- Aldrich	338818	Liquid
Disposable scalpels	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin	Sigma- Aldrich	G1890-100G	Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors	Sigma- Aldrich	S3146	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
Stericup Filters	Millipore	S2GPU05RE	Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes
Triton X-100	Sigma- Aldrich	9002-93-1	Liquid
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes