诱导小鼠角膜神经营养性角膜炎和神经再生的三种策略

摘要

在这里，我们提出了三种不同的方法来破坏支配角膜的感觉纤维。这些方法有助于研究小鼠的轴突再生。这三种方法适用于其他动物模型，是研究角膜神经支配生理学和再生的理想方法。

摘要

角膜是覆盖眼睛的透明组织，对于清晰的视力至关重要。它是体内神经支配最多的组织。这种神经支配为眼睛提供感觉和营养功能，并有助于保持角膜的完整性。这种神经支配的病理破坏称为神经营养性角膜炎。这可能是由眼睛受伤、手术或疾病引发的。在这项研究中，我们提出了三种不同的方案，以概括临床中常见的三种类型的病例的方式对神经支配造成损害。

第一种方法是用眼科毛刺磨损上皮。这涉及以类似于临床上进行的光折射性角膜切除术的方式切除上皮层、游离神经末梢和基底下神经丛。第二种方法仅针对神经支配，方法是用活检穿刺在外周切开神经支配，以保持上皮的完整性。这种方法类似于板层角膜移植术的第一步，导致神经支配退化，然后中央角膜中的轴突再生。最后一种方法使用多光子显微镜破坏转基因小鼠模型的神经支配，多光子显微镜特异性定位荧光神经纤维的烧灼位点。这种方法会造成与光性角膜炎相同的损害，即过度暴露在紫外线下。

本研究描述了研究角膜神经支配生理病理学的不同选择，特别是轴突的退化和再生。促进再生对于避免角膜上皮缺损甚至穿孔等并发症至关重要。所提出的模型可以帮助测试新的药理学分子或基因疗法，以增强神经再生并限制疾病进展。

引言

角膜是眼睛的透明表面，由三个不同的层组成：上皮、基质和内皮。该器官在体内具有最高的神经支配密度，主要由源自三叉神经节眼科分支的感觉纤维（Aδ 和 C 型）组成。感觉纤维以大束的形式穿透中基质中角膜的外围，这些束向外分支以覆盖表面。然后它们分叉以刺穿鲍曼膜并形成基底下丛，这很容易通过角膜中心形成的涡旋来识别。这些纤维终止于上皮外表面的游离神经末梢。它们能够转导热刺激、机械刺激和化学刺激，并释放对上皮稳态至关重要的营养因子 ^1,2。神经营养性角膜炎（NK）是一种影响角膜感觉神经支配的退行性疾病。这种罕见的疾病源于角膜敏感性的降低或丧失，导致角膜泪液分泌减少和愈合性能差³.NK 进展经历了三个明确描述的阶段，从患者出现上皮缺陷的第 1 阶段到发生基质融化和/或角膜穿孔的第 3 阶段⁴。

在临床上，这种疾病的起源可能是多种多样的。患者在眼睛受到物理损伤、手术或慢性疾病（如糖尿病）后可能会失去角膜神经支配 ^5,6。迄今为止，NK的发病机制过程仍然知之甚少，这种威胁视力的疾病的治疗选择非常有限。因此，需要更好地了解上皮缺损的特征，以更好地了解这些纤维再生背后的机....

研究方案

所有实验均获得国家动物实验委员会的批准。

1. 准备工作

1. 制备氯胺酮-甲苯噻嗪的麻醉溶液进行麻醉。通过将 200 μL 氯胺酮 （100 mg/mL） 和 125 μL 甲苯噻嗪 （20 mg/mL） 稀释在 2,175 mL 无菌 0.9% NaCl 中，注射 80 mg/kg 的氯胺酮和 10 mg/kg 的甲苯噻嗪。
2. 通过将 100 μL 0.3 mg/mL 丁丙诺啡加入 1,400 mL 无菌 0.9% NaCl 中，制备 0.02 mg/mL 丁丙诺啡溶液作为镇痛溶液。
3. 准备荧光染色溶液。
   1. 用细秤称取10mg荧光素盐，用10mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释，得到0.1%荧光素溶液。
   2. 保护溶液免受光线照射并摇晃5分钟。使用 10 mL 注射器和 0.2 μm 的注射器过滤器过滤溶液。
      注意：荧光溶液必须避光，并且可以在 +4 °C 下储存 5 天。
4. 鼠标的准备
   1. 通过腹膜内注射10μL / g小鼠重量（MW）的麻醉溶液来称量小鼠并诱导麻醉。当鼠标停止移动时，将其放在加热板（37°C）上，并通过捏住脚趾来验证其完全麻醉。
   2. 在接受手术的眼睛上滴一滴人工泪液，在对侧眼睛上滴一滴眼部凝胶。
   3. 一旦小鼠对捏无反应，以5μL / g....

讨论

神经营养性角膜炎被认为是一种罕见疾病，每 10,000 人中就有 5 人受到影响。然而，由于化学烧伤等身体伤害或糖尿病或多发性硬化症等综合征而患有NK的人不包括在这些统计数据中³。此外，这种情况仍然严重不足²²，并且该疾病的患病率被低估了。迫切需要新的治疗方法和疗法来促进轴突再生，作为保护患者视力的一种手段。目前，为NK早期阶段患者提供的唯?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm seringe filter	CLEARLINE	51733
0.5 mm rust ring remover	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mL plastic tubes	Eppendrof	30120094
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody	Abcam	ab18207
Antigenfix	Diapath	P0016
Artificial tear	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
Cotton swab	Any provider	N/A
Dissecting tools	Fine Science Tools	N/A
Fluorescein	Merck	103887
Gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765
Goat serum	Merck	S26
Head Holder	Narishige	SGM 4
Heated plate	BIOSEB LAB instruments	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software	Leica	N/A	Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II	Coherent	N/A
Laser power meter	Coherent	N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope	Leica	N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope	Zeiss	N/A
Ocry-gel	TVM lab	N/A
Parametric oscillator	Coherent	N/A
Penlights with blue cobalt filtercap	Bernell	ALPEN
Petri dish	Thermo Scientific	150318	Axotomy protocol
Petridish	Thermo Scientific	150288	Cornea whole-mount processing
Rompun 2%	Elanco	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm	LCH medical	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	Mounting medium