从小鼠中免疫磁性分离血管壁驻留的 CD34+ 干细胞

摘要

本研究为血管壁驻留CD34⁺ 干细胞（CD34⁺ VW-SCs）的分离、培养和功能测定建立了一种稳定高效的方法。这种易于遵循且省时的分离方法可以被其他研究人员用来研究心血管疾病涉及的潜在机制。

摘要

驻留 CD34⁺ 血管壁驻留干细胞和祖细胞 （VW-SCs） 因其在调节血管损伤和修复中的关键作用而日益得到认可。建立一种稳定有效的方法培养功能性小鼠CD34⁺ VW-SCs对于进一步研究这些细胞在各种生理和病理条件下的增殖、迁移和分化机制至关重要。所述方法结合磁珠筛选和流式细胞术纯化原代培养的驻留 CD34⁺ VW-SCs。然后通过免疫荧光染色和 Ca²⁺ 成像对纯化的细胞进行功能鉴定。简而言之，来自鼠主动脉和肠系膜动脉外膜的血管细胞是通过组织阻滞附着获得的，然后进行传代培养，直到达到至少 1 × 10⁷ 的细胞计数。随后，使用磁珠分选和流式细胞术纯化CD34 ⁺ VW-SCs。CD34⁺ VW-SCs 的鉴定涉及细胞免疫荧光染色，而功能多能性是通过将细胞暴露于特定培养基进行定向分化来确定的。此外，在暴露于 ATP、咖啡因或 thapsigargin （TG） 的 Fura-2/AM 负载细胞中，使用商用成像工作站评估功能性内部 Ca²⁺ 释放和外部 Ca²⁺ 进入。该方法为分离、培养和鉴定血管壁驻留CD34⁺ 干细胞提供了一种稳定高效的技术，为VW-SCs调控机制的 体外 研究和靶向药物的筛选提供了机会。

引言

血管壁在血管发育、稳态调节和血管疾病的进展中起着关键作用。近年来，许多研究揭示了动脉中存在各种干细胞谱系。2004年，徐清波教授课题组首次报道了成体血管壁外围存在血管干/祖细胞，表达CD34、Sca-1、c-kit和Flk-1¹。这些血管干细胞表现出多向分化和增殖潜力。在正常情况下，它们保持相对静止;然而，当被特定因素激活时，它们可以分化成平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。或者，它们可以通过旁分泌效应调节血管周围基质和微血管的形成，以促进受伤血管的修复或重塑 2,3,4,5,6。最近，发现血管壁中的常驻CD34⁺干细胞在股动脉导^{丝损伤后的}内皮细胞再生中起作用2。因此，CD34⁺ VW-SCs的分离和定量以及CD34⁺干细胞基本生物学特性的检验对于进一步研究CD34⁺ VW-SCs调控过程中的信号通路至关重要。

目前有多种细胞分离方法可用，包括基于细胞培养特性或细胞物理特性的....

研究方案

本研究获得批准，并按照《中国实验动物管理使用指南》对动物进行处理。本研究严格遵守动物实验的伦理要求，并经动物伦理委员会批准（批准文号：SWMU2020664）。本研究使用8周龄的健康C57BL / 6小鼠，体重在18-20g之间。这些动物被安置在西南医科大学（SWMU）的实验动物中心。

1. 来自主动脉和肠系膜动脉的外膜组织阻滞培养

1. 常驻 CD34⁺ VW-SCs 隔离
   1. 用3%异氟烷吸入麻醉两只小鼠（遵循机构批准的方案）。通过捏脚趾确认充分麻醉。用医用胶带将小鼠置于仰卧位，并喷洒 70% 乙醇消毒剂以消毒小鼠的皮毛。使用无菌眼科剪刀和镊子打开胸腔和腹腔，露出心脏和肠道。解剖分离的主动脉和肠系膜动脉后，将主动脉和肠系膜床固定在含有硅弹性体的培养皿中，并填充有生理盐溶液。用另一套消毒的剪刀和镊子，迅速解剖主动脉和肠系膜动脉周围的脂肪。
   2. 将解剖的组织转移到含有1%青霉素 - 链霉素 - 两性霉素B溶液的6cm培养皿中（参见 材料表）。冲洗两次后，将动脉转移到立体显微镜下的组织培养罩中。
   3. 纵向切开动脉，用细镊子剥去主动脉的外层和肠系膜动脉的第一分支。将外层转移到含有 0.1-0.2 mL 培养基的 3.5 cm 培养皿中（参见 材料表）。将外层切成小块（约 1 mm³

讨论

本研究提供了一种从小鼠主动脉和肠系膜动脉中获取功能性CD34⁺ VW-SCs的快速便捷的方法。该方法得到的CD34⁺ VW-SCs具有增殖活性和多向分化特性。三磷酸肌醇 1,4,5-三磷酸受体 （IP₃Rs）、兰尼定受体 （RyRs） 和储存操作的钙通道介导 Ca²⁺ 释放和进入 CD34⁺ VW-SCs。该技术的建立将为进一步研究CD34⁺ VW-SCs参与心血管疾病结构和功能重塑的机制奠定基础。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% gelatin solution	Sigma	G1393
Anti-CD31 antibody	R&D	AF3628
Anti-CD34 antibody	Abcam	ab81289
Anti-c-kit antibody	CST	77522
Anti-FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-FITC MicroBeads MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-Flk- 1 antibody	Abcam	ab24313
Anti-Ki67 antibody	CST	34330
Anti-PDGFRα antibody	Abcam	ab131591
Anti-Sca- 1 antibody	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC	eBioscience  Invitrogen	17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
cell culture hood	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
Centrifuge	CENCE	L530
CO2 incubators	Thermofisher Scientific	4111
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	zeiss 980
DMEM High Glucose Medium	ATCC	30-2002
EBM-2 culture medium	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™ System	BD
Fetal bovine serum	Millipore	ES-009-C
FM-2 culture medium	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Thermofisher Scientific	A32731
Leukemia inhibitory factor	Millipore	LIF2010
Microscope	Olympus	IX71
MiniMACS   Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Beyotime	C0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141
Stereo Microscope	Olympus	SZX10
TILLvisION 4.0 program	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-Mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	21985023