实验性自身免疫性脑脊髓炎后小鼠自身反应性抗体的定量

摘要

实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 是一种多发性硬化症 （MS） 动物模型，与人类疾病具有强大的体液自身免疫反应。在这里，我们报告了一种简单而灵活的ELISA方案，用于量化EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。

摘要

实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 是一种疾病模型，在组织病理学和分子水平上概括了自身免疫性疾病多发性硬化症 （MS）。EAE 是通过 皮下注射 短髓鞘肽和特定佐剂对实验动物进行免疫接种来诱导的，以增强免疫反应。与人类对应物一样，EAE小鼠会出现脱髓鞘病变，免疫细胞浸润到中枢神经系统（CNS），神经胶质细胞激活和神经元损伤。一致的证据也支持 B 细胞功能障碍在 MS 和 EAE 病因中的机制作用。B细胞可以作为抗原呈递细胞，也是促炎细胞因子和自身抗体的主要来源。在 EAE 中，产生针对用于诱发疾病的髓鞘肽的抗体。这种自身抗体已被证明可以介导髓鞘丢失或致病性 T 细胞再激活到中枢神经系统中。本文介绍了一种基于 ELISA 的有效方案，用于量化用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 35-55 （MOG35-55） 肽免疫的 C57BL/6J 小鼠血清中的自身抗体。所提出的方法是一种强有力的工具，可用于研究自身免疫性脱髓鞘背景下异常体液反应的特异性和程度。

引言

多发性硬化症 （MS） 是一种中枢神经系统 （CNS） 的慢性自身免疫性疾病，其特征是免疫细胞局灶性浸润到脑实质、包裹轴突的髓鞘破裂、神经胶质细胞活化和神经元丢失¹。除了致病性 T 细胞的公认作用外，多条证据还强调了 B 细胞参与介导针对中枢神经系统的自身免疫反应。B 细胞在 MS 脑中发生克隆扩增，并且在脱髓鞘病变中检测到针对髓鞘成分的抗体 ^2,3。最近有记录表明，外周 B 细胞在疾病发作时的选择性激活，表明该免疫细胞区室在疾病起始中也具有假定的作用⁴。B 细胞耗竭疗法（如抗 CD20 单克隆抗体）的成功进一步证实了异常 B 细胞功能与自身免疫性脱髓鞘之间的机制联系 ^5,6。从分子的角度来看，B 细胞可以通过自身抗原呈递、促炎细胞因子分泌和自身反应性抗体产生来导致疾病。

已经开发了多种动物模型来概括复杂 MS 表型的特定特征。其中，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是 体内 应用最广泛的范式，依赖于实验动物使用源自髓鞘蛋白的短肽进行免疫，如髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）和髓鞘碱性蛋白（MBP）^....

研究方案

所有涉及小鼠的程序均按照东卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的实验指南进行。本研究使用8-10周龄的野生型C57BL/6J雌性小鼠。这些动物是从商业来源获得的（见材料表）。EAE 是在先前发表的报告 12,13,14 之后诱导的。

1. 血清采集

1. 在通过MOG35-55免疫诱导EAE后，在所需的时间点（遵循机构批准的方案）通过CO₂窒息或异氟烷过量对实验小鼠实施安乐死。
   注：小鼠总数和血清收集的时间点可以根据具体实验而变化。
2. 在通过脚趾或尾巴捏确认没有生命体征后，将小鼠置于解剖托盘的背部卧位，并用别针或胶带将四肢固定到位。将鼠标身体对准 LED 光源（参见 材料表）以照亮动物的胸部。
3. 用70%乙醇喷洒小鼠皮毛，并使用解剖剪刀从骨盆到剑突沿腹部切开3-4厘米的中线切口，注意避免任何器官和主要血管（图1A-C）。为了方便该过程，请使用镊子抓住剑突上方的皮肤。

讨论

在这里，报道了一种简单有效的基于 ELISA 的方案，以准确量化 MS 病理学相关动物模型中的体液反应。该方法最近被用于描述 ataxin-1 蛋白在控制 MOG35-55/C57BL6J EAE 范式¹² 中自身抗体水平方面的新作用。在这方面，应该考虑许多因素，以便使用这种方法获得一致且具有生物学意义的结果。

首先，收集高质量的血清样本并避免溶血至关重要。在严重溶血的标本中?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	BD Biosciences	309628
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
25 G needles	BD Biosciences	305122
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate	Thermo Fisher	N301	Store at 4 °C
Adhesive seals	Thermo Fisher	AB0558
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906	Store at 4 °C
C57BL/6J female mice	The Jackson Laboratory	000664	Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments
Cryogenic tubes	Fisher	10-500-25
Dissection tray	Fisher	S111022
Dissector scissors	Fine Science Tools	14082-09
ELISA coating buffer	BioLegend	421701	Store at 4°C
Excel software	Microsoft		Analysis spreadsheet
Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP	SouthernBiotech	1030-05	Store at 4 °C
LED light source	Fisher	AMPSILED21
Microplate reader	Fisher	14-377-575
Molecular biology grade water	Corning	46-000-Cl
Mouse MOG35-55 peptide	EZBiolab	cp7203	Store at -80 °C
Multichannel pipette	Axygen	AP-12-200-P
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15011-12
Nunc MaxiSorp 96-well plates	BioLegend	423501
Orbital shaker	Fisher	88-861-023
Oven	VWR	445-0024
Phosphate buffer saline (PBS)	Thermo Fisher	14190144
Refrigerated tabletop centrifuge	Thermo Fisher	75002441
Stop solution	Thermo Fisher	N600
Tween 20	Bio-Rad	1706531