一套用于培养环境获得性厌氧微生物的 原位 信息模拟培养基格式

Summary

本文的重点是详细说明为从环境中获得的挑剔厌氧微生物制作培养基的最佳实践。这些方法有助于管理厌氧培养物，并可用于支持难以捉摸的未培养微生物（“微生物暗物质”）的生长。

Abstract

厌氧微生物的培养依赖性研究取决于方法学能力。这些方法必须为厌氧微生物创造和维持合适的生长条件（例如，pH值和碳源），同时还允许在不影响人工环境的情况下提取样品。为此，以 原位 环境为依据并模拟原位环境的方法对从该环境中培养微生物有很大帮助。在这里，我们概述了一种用于培养陆地表面和地下微生物的 原位 知情和模拟厌氧方法，强调以最小的扰动收集厌氧样本。该协议详细介绍了可定制厌氧液体培养基的生产，以及厌氧微生物的环境获取和 体外 生长。该协议还涵盖了厌氧生物反应器的关键组件，该反应器用于沉积物的环境模拟和环境获取培养物的厌氧液体培养基。我们纳入了在生物反应器的整个生命周期内来自维持的微生物组的初步下一代测序数据，其中活性培养物根据实验碳源进行动态调整。

Introduction

大多数微生物仍未培养;通过显微镜观察到的细胞之间的巨大差异与使用琼脂平板成功培养的少数微生物形成鲜明对比。Staley 和 Konopka 将这种差异命名为“大板块计数异常”¹。宏基因组学和宏转录组学数据支持估计的未解释多样性，这些数据显示许多新属分布在几种不同环境的等级丰度曲线^{中 2}.已观察到的微生物（通常通过微生物群落的随机鸟枪测序）但尚未培养的微生物被称为“微生物暗物质”^3,4。

在组学时代，培养微生物对于全面评估基因组数据和验证现有基因的功能/表型仍然至关重要。对培养的微生物进行测序仍然是自信地获得完整基因组的唯一方法，直到鸟枪法宏基因组学和来自环境的宏基因组组装基因组等技术变得绝对可靠⁵。基因组评估与培养的微生物相结合，为理解“微生物暗物质”提供了强有力的推论。“微生物暗物质”的许多成员发挥着影响营养物质和其他元素循环以及有价值的天然产物生产的关键功能，支持生态系统并执行生态服务。从医学角度来看，目前销售的所有药品中约有一半是细菌产品和衍生物，对未培养物种的分析被怀疑揭示了未来的抗生素。为了获得这一未开化的大多数，必须增加各种培养方法

Protocol

1.可定制厌氧液体介质的生产

1. 培养瓶培养基（产量 500 mL）
   1. 测量化合物并将其添加到 1 L 瓶中，并使用 表 1 中与读者感兴趣的培养物相对应的色谱柱调节 pH 值（ 表 1 中的量记录为 1,000 mL 的产量，相应调整）。通过旋转瓶子将化合物混合至均匀。
   2. 通过微波炉加热瓶子 5-6 分钟，将液体加热至沸腾。经常打开微波炉，用耐热手套轻轻旋转液体。如果液体冒泡后静止不动，请迅速打开微波炉;否则，液体可能会迅速膨胀并溢出瓶子。
   3. 将无菌的 10 mL 玻璃移液器连接到 N₂ 气体歧管装置上（基于 Balch 等人 ¹¹ 的设计，但不需要加热铜柱来加热纯度的 N₂ 气体;有关气体歧管的更多信息，请参阅 补充文件 1 ）。打开歧管排出 O₂ 并让 N₂ 气体流出。
   4. 将移液器吸头放入液体中并调节气体流量，使气泡具有适度的活力。用 N₂ 冲洗液体，直到瓶子不再太热而无法触摸。
      注意：这取决于媒体的内容，但通常需要 ~20 分钟。
   5. 在等待瓶子冷却的同时，放置 10 个无菌 100 mL 培养瓶;或者，如果准备用于收集土壤....

Discussion

该协议的培养基生产部分（第 1 节）的结构归功于 Miller 和 Wolin¹⁷ 的改进的 Hungate 技术，该技术自发布以来一直被广泛使用。这种扩展方案的实用性来自其描述性以及与微生物 的原位 采集的配对。含有环境知情和模拟培养基的培养瓶已被用于 在原位获得的“微生物暗物质”的前成员中成功培养以下：厌氧地下细菌 Thermoanaerosceptrum fracticalcis 菌株 DRI13

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Materials
1 L borosillicate bottle	Fisher Scientific
1 mL syringe with slip tip	Fisher Scientific
10 mL glass pipette	Fisher Scientific
100 mL culture bottle	Fisher Scientifc
20 mm hand crimper	Fisher Scientifc
23 G needle	Fisher Scientifc
500 mL borosilicate bottle	Fisher Scientific
Aluminum seal	Fisher Scientifc
Cannula, 31.5 cm length	Fisher Scientific
Cannula, 6 cm length	Fisher Scientifc
Corer	Giddings Machine Company		Assembled from company parts
Gas manifold	Swagelok		Assembled from many different parts
Lighter	Lowe's
N2 gas	Airgas
Nitrile gloves	Fisher Scientific
Rubber stopper (for GL45 bottles)	Glasgeratebau OCHS
Rubber stopper (for culture bottles)	Ace Glass
Stirring hot plate	Corning
Trace minerals	ATCC
Vitamins	ATCC
Bioreactor-specific Materials
#10 rubber stopper	Ace Glass
#7 rubber stopper	Fisher Scientifc
1 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
1/4" hose barb ball valve	Amazon
10 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
3.5 L borosilicate bottle	Fisher Scientific
5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting	Amazon
60 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
8 L borosillicate carboy	Allen Glass
Angled hose connector for GL14 open top cap	Ace Glass	7623-20
Balloon	Party City
Borosillicate bioreactor	Allen Scientific Glass		Custom made upon request
Drill	Lowe's
Female luer lock adapter coupler	Amazon
GL14 open top cap	Ace Glass	7621-04
GL18 open top cap	Ace Glass	7621-08
GL45 open top cap	Ace Glass
PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap	Ace Glass	7625-06
PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap	Ace Glass	7625-07
Ring stand	Fisher Scientific
Ring stand chain clamp	Amazon
Ring stand clamp	Fisher Scientific
Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od	Grainger	55YG13
Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od	Grainger
Straight hose connector for GL14 open top cap	Ace Glass	7623-22
Three-way stopcock	Amazon
Two-way stopcock	Amazon
Ultra low flow variable flow mini-pump	VWR
Water bath	Fisher Scientifc
White rubber septum for 13-18 mm od tubes	Ace Glass	9096-49
Wire	Lowe's
Zip tie	Lowe's